萊菔硫烷對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肺組織內(nèi)血紅素加氧酶-1及環(huán)氧合酶表達(dá)的影響

孔文基

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾 161002)

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·論 著·

萊菔硫烷對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肺組織內(nèi)血紅素加氧酶-1及環(huán)氧合酶表達(dá)的影響

孔文基

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾 161002)

目的 探討萊菔硫烷對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)肺組織血紅素加氧酶-1(HO-1)及環(huán)氧合酶(COX)表達(dá)的影響。方法 將72只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(N組)、SAP模型組(SAP組)和萊菔硫烷組，每組各24只，分別于術(shù)后3、6、12 h對(duì)各組進(jìn)行肺損傷評(píng)分、檢測(cè)肺組織濕干比(W/D)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、HO-1 mRNA、COX mRNA的表達(dá)量。結(jié)果 SAP組的各指標(biāo)均明顯高于N組(P<0.05)；萊菔硫烷組的病理評(píng)分、肺W/D值、TNF-α、IL-1β、COX-2 mRNA表達(dá)量較SAP組明顯降低(P<0.05)，HO-1 mRNA表達(dá)量較SAP組明顯升高(P<0.05)；相關(guān)性分析示HO-1 mRNA表達(dá)量與COX-2 mRNA、TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 萊菔硫烷增加了SAP肺組織中HO-1的表達(dá)量從而減輕急性肺損傷，這可能與通過(guò)抑制COX表達(dá)有關(guān)。

重型胰腺炎； 萊菔硫烷； 血紅素加氧酶-1； 環(huán)氧合酶

早期的急性胰腺炎約15%～30%發(fā)展為重癥急性胰腺炎，由于病情發(fā)展迅速，不僅表現(xiàn)為胰腺組織局部的缺血壞死，而且常常伴有其他多臟器功能的損害，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征。其中尤以急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病率最高也最嚴(yán)重。炎性反應(yīng)在重癥急性胰腺炎所致的急性肺損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，尤其是大量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)[1]。環(huán)氧合酶2(COX-2)是前列腺合成的一種重要前炎性介質(zhì)，相關(guān)研究證實(shí)了COX-2介導(dǎo)了急性胰腺炎及相關(guān)肺損傷的炎性反應(yīng)過(guò)程[2-3]，但是具體機(jī)制尚未完全闡明。血紅素加氧酶1(HO-1)具有抗氧化、抗感染等一系列生物學(xué)效應(yīng)，參與機(jī)體的多種病理生理過(guò)程，在調(diào)控多種急性肺損傷(ALI)炎性介質(zhì)的基因表達(dá)起重要作用[4]，萊菔硫烷對(duì)多種疾病的損傷具有保護(hù)作用，成為各個(gè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究旨在探討萊菔硫烷HO-1重癥急性胰腺炎大鼠肺組織內(nèi)HO-1及環(huán)氧合酶(COX)的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 取健康雄性Sprague-Dawley大鼠共72只，體質(zhì)量220～260 g，由本院動(dòng)物房提供。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 試劑 牛黃膽酸鈉(Sigma公司)，RT-PCR試劑盒(深圳晶美生物公司)，牛血晶素(B&D公司)，萊菔硫烷(Sulforaphane)購(gòu)于美國(guó)LKT公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和模型制作 將72只SD大鼠分為對(duì)照組(N組)、SAP模型組(SAP組)、HO-1萊菔硫烷組(萊菔硫烷組)，每組各24只。SAP模型制作，采用傳統(tǒng)的5%牛黃膽酸鈉法建立SD大鼠SAP模型。實(shí)驗(yàn)前12 h內(nèi)禁食，自由飲水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后逐層開(kāi)腹，暴露胰腺和十二指腸。用微量泵逆行膽胰管內(nèi)勻速內(nèi)注射5%牛黃膽酸鈉(1 mL/kg)，約5 min后當(dāng)觀察到大鼠胰腺組織出現(xiàn)彌漫性出血點(diǎn)時(shí)，拔出針頭，去除血管夾，連續(xù)縫合管壁腹腔。N組開(kāi)腹后僅用棉簽輕輕反動(dòng)胰腺和小腸后關(guān)腹，不注射牛黃膽酸鈉。萊菔硫烷組于造模后30 min腹腔注射萊菔硫烷10 mg/kg。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 各組大鼠分別于術(shù)后3、6、12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠，用10%的水合氯醛腹腔麻醉，并取組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.1 肺組織病理 開(kāi)胸取右肺上葉，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行評(píng)分。

1.3.2.2 肺濕干重比測(cè)定 取右下肺紗布拭干后稱重記為肺濕重(W)，隨后放于80 ℃烤箱中，每天稱重1次，待重量穩(wěn)定后記為肺干重(D)，兩者的比值為(W/D)。

1.3.2.3 肺組織炎癥因子的檢測(cè) 取左肺液氮速凍組織用于炎癥因子(TNF-α和IL-1β)、HO-1和COX-2的檢測(cè)。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)肺組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，HO-1和COX-2的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)方法：采用TRIzol法提取組織總RNA，取等量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，HO-1上游引物為5′-ATC ATG GCT TGG CCT ACA TTG-3′,下游引物為5′-CAC GGA TGT GCA CCT CCT T-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為107 bp；COX-2上游引物為5′-TCA AAA GAA GTG CTG-GAA AAG GTT-3′,下游引物為5′-TCT ACCT-GAG TGT CTT TGA CTG TG-3′(296 bp)；β-actin上游引物為5′-TGA CAG GAT GCA GAA GGA GA-3′，下游引物為5′-TAG AGC CAC CAA TCC ACA CA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 20 μL，其中5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L)1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL，M-MLV RTase(200 U/μL)0.5 μL，RNase Inhibitor (40 U/μL)0.5 μL，RNase free dH2O 9 μL，總RNA 4 μL；反應(yīng)條件為25 ℃×10 min，42 ℃×30 min，95 ℃×2 min。qPCR反應(yīng)體系20 μL，其中SYBR super-Mix熒光10 μL，模板混合液(上游、下游引物)1 μL，超純水5 μL，稀釋2倍cDNA 4 μL；反應(yīng)步驟為第1步：95 ℃×8.5 min；第2步：95 ℃×15 s，58 ℃×1 min，循環(huán)45次。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分 與N組比較，SAP組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)大量滲出液，間質(zhì)充血、水腫，炎性細(xì)胞明顯增多，萊菔硫烷組出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較SAP組明顯減輕，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺病理評(píng)分結(jié)果顯示(表1)：SAP組的病理評(píng)分明顯高于N組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；萊菔硫烷組的病理評(píng)分明顯低于SAP組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠肺組織濕干重比變化 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP組與N組相比，肺W/D值明顯升高，且在各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；萊菔硫烷組的肺W/D在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于SAP組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 不同時(shí)間處理組肺組織病理評(píng)分分)

注：與N組比較,*P<0.05;與SAP 組比較,#P<0.05。

表2 不同時(shí)間處理組肺W/D值比較

注：與N組比較,*P<0.05；與SAP 組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠炎癥因子的表達(dá)水平比較 SAP組大鼠肺組織中的TNF-α、IL-1β表達(dá)量明顯高于N組(P<0.05)，在12 h內(nèi)呈不斷升高趨勢(shì)。用萊菔硫烷干預(yù)處理后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)萊菔硫烷組的大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β的水平較SAP組明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同處理組肺組織炎癥因子水平比較

注：與N組比較,*P<0.05；與SAP 組比較，#P<0.05。

2.4 各組大鼠HO-1和COX-2 mRNA表達(dá)變化 造模后SAP組大鼠肺組織中的HO-1 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，予以萊菔硫烷干預(yù)后，萊菔硫烷組的HO-1 mRNA表達(dá)量較SAP組明顯升高(P<0.05)。SAP組的COX-2 mRNA表達(dá)水平較N組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，萊菔硫烷組COX-2 mRNA表達(dá)量較SAP組明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同處理組大鼠HO-1 和COX-2 mRNA表達(dá)量變化

注：與N組比較,*P<0.05；與SAP 組比較，#P<0.05。

2.5 SAP肺組織中HO-1 mRNA和COX mRNA、TNF-α、IL-1β的相關(guān)性分析 通過(guò)多元相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)隨著COX-2 mRNA表達(dá)量的增高，TNF-α、IL-1β的水平也明顯增高，呈正相關(guān)性(r分別為0.436、0.375，P<0.05)；HO-1 mRNA表達(dá)量與COX-2 mRNA、TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r分別為-0.758、-0.425、-0.389，P<0.05)。

3 討 論

急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(APALI)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大量研究證實(shí)了炎性介質(zhì)和炎癥細(xì)胞的激活在介導(dǎo)APALI過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，尤其是TNF-α和IL-1β[5]。相關(guān)研究提示COX-2在炎性反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6]，一方面TNF-α、IL-1β等炎癥因子可以上調(diào)COX-2的表達(dá)，另一方面COX-2可進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)和過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，在損傷的炎性反應(yīng)過(guò)程中形成了一個(gè)惡性循環(huán)。目前大量研究表明COX-2參與了多種急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制過(guò)程，抑制COX-2的表達(dá)對(duì)缺血再灌注肺損傷、機(jī)械通氣肺損傷、膿毒癥肺損傷等均具有一定的保護(hù)作用[7-9]。Ethridge等[10]研究證實(shí)了破壞COX-2相關(guān)基因的表達(dá)可以減輕急性胰腺炎及APALI。HO-1作為內(nèi)源性的保護(hù)蛋白近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，而萊菔硫烷相關(guān)報(bào)道指出其與HO-1、COX-2具有一定的相關(guān)性，但其在APALI 中的具體作用機(jī)制尚未完全闡明，本研究主要探討了萊菔硫烷對(duì)APALI的HO-1與COX-2炎性反應(yīng)的相關(guān)性。

本文研究結(jié)果顯示，造模后SAP組大鼠肺組織的濕干比、肺病理?yè)p傷評(píng)分及炎癥因子的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高，表明了APALI過(guò)程伴隨肺水腫、肺損傷程度的加重，且SAP誘導(dǎo)了TNF-α、IL-1β表達(dá)水平的明顯升高。值得注意的是SAP組的HO-1 mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照也明顯增高，為了進(jìn)一步證實(shí)萊菔硫烷在APALI中的作用，本研究予以萊菔硫烷干預(yù)，結(jié)果肺組織中HO-1 mRNA的表達(dá)量較SAP組明顯升高，同時(shí)伴隨COX-2 mRNA、TNF-α、IL-1β表達(dá)量的下降，呈負(fù)相關(guān)，肺水腫、肺組織病理萊菔硫烷干預(yù)組也較SAP組明顯好轉(zhuǎn)。因此，本研究證實(shí)了萊菔硫烷誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)的升高對(duì)APALI起到一定的保護(hù)作用。應(yīng)用萊菔硫烷上調(diào)HO-1的表達(dá)有可能成為治療APALI的新思路和方法。萊菔硫烷是一種可以食用的異硫氰酸鹽，主要存在于花菜、西蘭花以及甘藍(lán)等十字花科植物中，日常食用西蘭花(200 mg/d)可以有效地減少自發(fā)性高血壓大鼠的高血壓水平，炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷。相關(guān)報(bào)道指出萊菔硫烷可以誘導(dǎo)多種組織細(xì)胞HO-1的表達(dá)，而HO-1除了分解血紅素外，其代謝產(chǎn)物CO和膽綠素等在體內(nèi)具有重要的生物學(xué)效應(yīng)，包括抗氧化、抑制炎性反應(yīng)等，激活HO-1相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)HO-1的表達(dá)對(duì)多種肺損傷具有保護(hù)作用[11-12]。目前HO-1和COX-2之間的具體作用機(jī)制尚未完全明確，有研究表明HO-1有可能是通過(guò)MAPKs和Nrf2XIANG相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)抑制COX-2的表達(dá)[13]，HO-1也可通過(guò)促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)來(lái)減輕炎性反應(yīng)，例如IL-10，這樣萊菔硫烷可能通過(guò)調(diào)控HO-1與COX-2通路起到減輕肺組織損傷的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了萊菔硫烷可上調(diào)HO-1的表達(dá)量，而HO-1可能通過(guò)抑制COX-2、TNF-α、IL-1β表達(dá)而對(duì)APALI起到一定的保護(hù)作用，為臨床治療APALI提供了新的靶點(diǎn)和治療思路，值得進(jìn)一步深入研究。

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Effects of sulforaphane on expression of HO-1 and COX in lung tissue of severe acute pancreatitis rat

KongWen-ji

(DepartmentofPharmacy,ThirdAffiliatedHospitalofQiqihaerMedicalCollege,Qiqihaer,Heilongjiang161002,China)

Objective To study the effects of sulforaphane on the levels of HO-1 and COX-2 in the lung tissue of severe acute pancreatitis(SAP) rat model.Methods Seventy-two rats were randomly divided into three groups:control group(N group),SAP model group(SAP group) and sulforaphane group,24 cases in each group.The lung injury evaluation,wet-to-dry(W/D) ratio,levels of TNF and IL-1β protein and expression of HO-1 and COX-2 mRNA were measured at 3,6,12 h after operation.Results Compared with the N group,the levels of every indexes in the SAP group were higher (P<0.05).In the comparison with the SAP group,the pathological scores,W/D ratio,levels of TNF and IL-1β protein and expression of COX-2 mRNA were lower in the sulforaphane group,while expression of HO-1 mRNA was higher(P<0.05).The expression amounts of HO-1 mRNA showed the significantly negative correlation with the expression levels of TNF and IL-1β protein and expression of COX-2 mRNA(P<0.05).Conclusion Sulforaphane can reduce the lung injury by increasing the expression amount of HO-1 in lung,which may be related with inhibiting the expression of COX.

severe acute pancreatitis； sulforaphane； HO-1； COX

孔文基,女,本科,主管藥師,主要從事藥學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.034

A

1672-9455(2015)14-2056-03

2015-01-25

2015-03-15)