胡麗慶，王 盛，史煜波，翁幸鐾

產(chǎn)氣腸桿菌連續(xù)分離株的耐藥性及β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制的研究

胡麗慶，王 盛，史煜波，翁幸鐾

目的 探討臨床連續(xù)分離的產(chǎn)氣腸桿菌耐藥性及耐碳青霉烯類藥物菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要機制。方法 用Vitek2-Compact儀對臨床連續(xù)分離的240株產(chǎn)氣腸桿菌進行鑒定和常規(guī)藥敏試驗，并篩選出耐碳青霉烯類藥物的菌株；用瓊脂稀釋法測定其對碳青霉烯類藥物的MIC值；用改良的三維試驗方法分別檢測耐藥菌株的ESBLs與AmpC酶；改良Hodge試驗法檢測碳青霉烯酶；用PCR擴增法檢測3種β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因；結(jié)果 240株產(chǎn)氣腸桿菌對23種常用抗生素的耐藥率在3.8%～100%之間，最高為頭孢西丁(100%)、最低為亞胺培南(3.8%)；篩選出10株耐碳青霉烯類產(chǎn)氣腸桿菌；三維試驗10株菌ESBLs 及AmpC酶均為陽性，Hodge試驗陽性7株。PCR結(jié)果示，攜帶blaKPC基因7株；攜帶blaCTX-M基因7株，攜帶blaSHV基因2株；攜帶blaDHA基因6株，攜帶blaACT/MIR型ampC基因4株； 16SrRNA基因定量確定ampC基因的表達增加的3株。結(jié)論 產(chǎn)氣腸桿菌對臨床常用抗菌藥物具有較高的耐藥性，其主要耐藥機制為產(chǎn)碳青霉烯酶、ESBLs與AmpC酶。

產(chǎn)氣腸桿菌；blaKPC；ESBLs；ampC基因

Supported by the Zhejiang Medicine and Health Scientific Research Fund (No. 2011KYB099)

產(chǎn)氣腸桿菌是條件致病菌，隨著各種抗生素的廣泛使用，在醫(yī)院的感染中呈不斷上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)耐藥菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是其對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制，此種機制造成的細菌耐藥占到耐藥菌株的80%[1]。但近些年來有關(guān)產(chǎn)氣腸桿菌耐藥機制的研究報道相對較少，筆者對240株從臨床連續(xù)分離的菌株進行了相關(guān)耐藥情況分析與耐藥機制的研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2009年1月至2012年7月從本院不同病區(qū)連續(xù)分離的產(chǎn)氣腸桿菌保存菌株240株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑 全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek2-Compact及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI)、革蘭陰性桿菌藥敏卡(GNS)均購自法國梅里埃公司；PE-9700 PCR儀(美國ABI公司)；Eppendorf 5417R高速離心機(德國艾本得)；Bio-Rad GelDoc凝膠電泳成像分析系統(tǒng) (美國伯樂公司)；MH瓊脂干粉，頭孢西丁紙片(FOX)，頭孢曲松紙片(CRO)均購自英國OXOID公司；鄰氯西林(CLO)，克拉維酸(CA)均購自上海四藥有限公司，亞胺培南(IPM)、厄他培南(ETP)藥物粉劑購自杭州默沙東醫(yī)藥公司；厄他培南藥敏紙片由杭州默沙東醫(yī)藥公司贈送；美洛培南(MEM)藥物粉劑購自日本住友制藥有限公司；PCR通用試劑盒EmeraldAmpTMPCR Master Mix及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2,000TMDNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司新產(chǎn)品，6種碳青霉烯類酶耐藥基因的引物blaKPC、blaNDM-1、blaGES、blaSME、blaIMI-1 /NmcA和blaSHV-38；5種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因；AmpC酶基因blaDHA和blaACT/MIR；AmpC基因表達檢測的16SRNA引物及探針(見表1)均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 5種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因和2種AmpC酶基因的引物及擴增產(chǎn)物的大小

1.3 菌株鑒定及常規(guī)藥敏試驗 按全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek2-Compact及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI)和革蘭陰性桿菌藥敏卡(GNS)使用說明書。對篩選出的10株耐碳青霉烯類藥物的產(chǎn)氣腸桿菌進行重新鑒定與藥物敏感性試驗，確定菌株鑒定正確及對碳青霉烯類藥物仍然耐藥。

1.4 MIC值測定 用M-H瓊脂稀釋法測定亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦對篩選出的10株耐碳青霉烯類藥物的產(chǎn)氣腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)，方法參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。操作如下，將不同劑量的藥物，加入融化并冷至50 ℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板(濃度梯度分別為：0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL瓊脂)，接種受試菌，孵育后觀察細菌生長情況，將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。

1.5 改良的Hodge試驗 參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進行[2]，0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮竽c埃希菌ATCC25922菌液10倍稀釋后均勻涂布MH平板，中間貼上ETP(10 μg)紙片，再用無菌接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣劃線，35 ℃孵育16～18 h后觀察結(jié)果，結(jié)果判斷：厄他培南抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢菌矢狀生長者為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。

1.6 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及AmpC酶的表型檢測 采用頭孢曲松的三維試驗方法[3]檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)；采用頭孢西丁的三維試驗法[4]檢測AmpC酶。

1.7 模板DNA的提取 10株碳青霉烯類藥物耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌經(jīng)血瓊脂平板36 ℃培養(yǎng)18 h后，取菌落于裝有150 μL純水的無菌離心管中成菌懸液，于100℃水浴中煮15 min，冷卻后于高速離心機中離心8 000 r/min,5 min,取上清液(模板DNA)-20 ℃保存待用。

1.8 多種β-內(nèi)酰胺酶的基因檢測 用PCR法檢測10株碳青霉烯類藥物耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌的6種碳青霉烯酶基因，blaKPC、blaNDM-1、blaGES、blaSME、blaIMI-1 / NmcA和blaSHV-38，具體的操作方法，見參考文獻[5]；5種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M1、blaCTX-M2、blaCTX-M9、blaTEM、blaSHV-38；2種AmpC酶基因blaDHA和blaACT/MIR并測序，操作方法參考文獻[6]。

1.9 AmpC基因表達檢測 使用qRT-PCR法檢測定量16S rRNA基因定量確定ampC基因表達，以臨床分離ampC基因檢測陰性，亞胺培南、美羅培南均敏感的產(chǎn)氣腸桿菌作為本底對照1，以倍數(shù)來確定表達情況，具體操作見文獻[7]。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)藥敏試驗結(jié)果 240株產(chǎn)氣腸桿菌對常用23種抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果，耐藥率最高的為頭孢西丁100%，其次為頭孢唑林91.2%；耐藥率最低的為亞胺培南3.8%,其次為美洛培南4.4%。對其他抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果見表2。

2.2 MIC值測定結(jié)果 10株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌對7種抗菌藥物的瓊脂稀釋法檢測的MIC值結(jié)果見表3。

表2 240株產(chǎn)氣腸桿菌對常用23種抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果

表3 10株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌對7種抗菌藥物的MIC值(μg/mL)

2.3 改良Hodge試驗、ESBLs及AmpC酶表型檢測及耐藥基因檢測結(jié)果 10株碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌，三維試驗ESBLs及AmpC酶均陽性，Hodge試驗陽性7株；6種碳青霉烯酶基因中檢測到blaKPC基因陽性7株，未檢測到blaNDM-1、blaGES、blaSME、blaIMI-1 / NmcA和blaSHV-38基因；ESBLs基因BlaCTX-M陽性7株，BlaSHV陽性2株；AmpC酶基因blaDHA陽性6株，blaACT/MIR陽性4株；16S rRNA基因定量確定ampC基因的表達增加的3株分別為1，4，7號產(chǎn)氣腸桿菌，qRT-PCR擴增圖及相對表達量見圖1與圖2，其他結(jié)果詳見表4。

表4 10株碳青霉烯類藥物耐藥菌株耐藥基因檢測結(jié)果

3 討 論

產(chǎn)氣腸桿菌為腸桿菌科常見細菌，是菌血癥中的主要病原菌，其死亡率可達10.2%[8]。有關(guān)報道顯示，產(chǎn)氣腸桿菌對臨床常用的抗菌藥物具有較高的耐藥率[9],而本院連續(xù)分離的240株產(chǎn)氣腸桿菌耐藥敏率略底于文獻報道，藥敏結(jié)果表2顯示對常

Three strains overproduced AmpC β-lactamase, no. 1, 4, and 7 curves in this map.

圖1 熒光實時定量qRT-PCR檢測AmpC基因表達的16SRNA擴增圖

Fig.1 Amplification plot of real-time quantitative PCR for the testing chromosomal 16S rRNA ofampCgenes expression

1-10:Relative expression level ofampCgenes for 10 strains; ntc: Negative control (reference strain)

圖2 10株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌AmpC基因相對表達量

Fig.2 Relative expression level ofampCgenes for 10 strains of carbapenems resistantEnterobacteraerogens

用抗菌素耐藥率最高的是一代、二代頭孢及頭霉素類(頭孢唑啉、頭孢呋辛及頭孢西丁均大于90%)和氨芐西林73.9%；耐藥率相對較低的是頭孢曲松41.2%、頭孢吡肟32.5%，由于革蘭陰性菌產(chǎn)ESBLs 的比例較高，產(chǎn)AmpC酶菌的比例在增加，三代頭孢作為醫(yī)院內(nèi)中、重度感染首選的安全性在降低，而第四代頭孢菌素的頭孢吡肟因能快速通過細菌外膜屏障對高產(chǎn)AmpC酶細菌的抗菌活性較好，若細菌不產(chǎn)生ESBLs等，可考慮選用；碳青霉烯類美洛培南、亞胺培南和氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率最低，均低于5%，且碳青酶烯類抗菌藥物對絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶，包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC穩(wěn)定，對腸桿菌科細菌一直保持很高的抗菌活性，是目前治療腸桿菌科細菌感染最有效的抗菌藥物[10]，但針對目前出現(xiàn)的為數(shù)不少的耐藥株應(yīng)當(dāng)引起臨床和實驗室的重視；其中酶抑制劑復(fù)合制劑的耐藥率氨芐西林/舒巴坦>阿莫西林/克拉維酸>哌拉西林/他唑巴坦,分別為65.3%、25.8%、23.1%，產(chǎn)AmpC酶是產(chǎn)氣腸桿菌對三代頭孢菌素和酶抑制劑復(fù)合制劑產(chǎn)生耐藥的主要原因，復(fù)合制劑對ESBLs有效，對AmpC酶無效，覆蓋面更廣危重感染仍然以碳青霉烯類為首選。

為進一步深入了解本院產(chǎn)氣腸桿菌的耐藥機制，本研究對篩選出的10株碳青霉烯類藥物耐藥菌株進行多種β-內(nèi)酰胺酶的檢測。表4結(jié)果顯示， ESBLs 和AmpC酶均陽性，7株Hodge試驗陽性。PCR結(jié)果顯示，本院的碳青霉烯酶以blaKPC2為主。KPC型碳青霉烯酶是一種非金屬碳青霉烯酶，可水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物，也是產(chǎn)氣腸桿菌耐碳青酶類藥物的重要原因；本院產(chǎn)氣腸桿菌攜帶ESBLs的基因有多種，以blaCTX-M和blaSHV為主AmpC酶基因以blaDHA和blaACT/MIR型為主；對AmpC酶過表達株的研究顯示，其中1、4、7號菌株16SrRNA基因定量表達明顯增加，分別為87.7、102.2、96.3。文獻報道AmpC酶過度表達可造成菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥[7]，本研究結(jié)果顯示，此3株過度表達菌，雖然碳青酶烯類藥物耐藥的多種基因陰性，但仍對亞胺培南與美洛培南耐藥也說明這一耐藥機制的存在。研究還表明，菌株同時攜帶多種耐藥基因的重疊組合，這使細菌的耐藥性起到了疊加或協(xié)同作用。

抗菌藥物尤其是三代頭孢菌素的應(yīng)用與ESBLs的感染流行有相關(guān)性，有報道ESBLs的暴發(fā)流行與頭孢他啶的消耗量成正相關(guān)，而限制頭孢他啶的使用，則可減少ESBLs菌的流行[11-12]。而質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶在細菌中的傳播已呈增長趨勢，新的質(zhì)粒AmpC酶亞型在不同細菌中層出不窮。且由于質(zhì)粒有傳遞性，此類酶可在不同細菌間傳播，容易引起暴發(fā)流行[13]。在國外，質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶以CMY-2型最為流行[14]，而本研究基因測序結(jié)果顯示主要為blaDHA和blaACT/MIR型，表明我國的流行株與國外有所不同。鑒于AmpC酶可被β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物誘導(dǎo)，屬于誘導(dǎo)酶，不被克拉維酸抑制但可被氯唑西林抑制[15]，目前第四代頭孢和碳青霉烯類仍然是治療產(chǎn)AmpC酶菌株的有效藥物，臨床經(jīng)驗性用藥一般首選碳青霉烯類，其次是β-內(nèi)酰酶類藥物和酶抑制劑、頭霉類抗菌藥物及其他敏感抗菌藥物。但為了避免產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶，臨床上在使用碳青霉烯類藥治療時還是應(yīng)考慮聯(lián)合用藥。

不斷出現(xiàn)的產(chǎn)酶耐藥株給臨床抗菌治療帶來了極大的困難，對臨床連續(xù)分離菌株進行耐藥性及耐藥機制的檢測能明確某一階段耐藥菌株的耐藥性變化，這有利于耐藥基因分子流行機制的研究。臨床實驗室及時準(zhǔn)確地對某一階段臨床分離菌株進行耐藥菌株的監(jiān)測，對規(guī)范臨床抗生素的合理選用，控制耐藥菌株的播散和流行，具有非常重大的意義。

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Drug-resistance on consecutive clinical isolates
ofEnterobacteraerogenesand its resistance mechanism to β-lactamses

HU Li-qing,WANG Sheng,SHI Yu-bo,WENG Xing-bei

(ClinicalLaboratory,theFirstHospitalofNingboCity,Ningbo315000,China)

The aim is to investigate the antibiotics resistance of consecutive clinical isolates ofEnterobacteraerogensand the main resistance mechanism to β-lactamses for carbapenems resistant isolates. The Vitek 2-Compact instrument was used to identify the 240 strains ofEnterobacteraerogensfrom clinic, and the antimicrobial susceptibility was tested, while the carbapenems-resistant isolates were screened. The minimum inhibition concentration of carbapenems was tested by standard agar dilution method. The ESBLs and AmpC β-lactamase were detected with three-dimensional test. The KPC carbapenemase were detected by Hodge test and the genotypes of β-lactamses were performed by PCR method. Results showed that the resistance rates of 240Enterobacteraerogensstrains to the common antibiotics were from 3.8% to 100%. The highest one was cefoxitin (100%), and the lowest was imipenem (3.8%). Ten carbapenems-resistant strains ofEnterobacteraerogenswere screened from 240 isolates. Both ESBLs and AmpC β-lactamase were positive in all of 10 isolates, and 7 isolates in Hodge test were positive. PCR experiment showed that among the 10 strains, there were 7 strains carryingblaKPC, 7 strains carryingblaCTX-M, 2 strains carryingblaSHV, 6 strains carryingblaDHA, 4 strains carryingblaACT/MIR, and 2 strains carrying high expression levels of the chromosomalampCgene. It’s suggested that there is high antibiotic resistance to common antimicrobial agents of clinicalEnterobacteraerogens. The main cause for antibiotics resistance ofEnterobacteraerogensis producing β-lactamase such as carbapenemase, ESBLs and AmpC bate-lactamase.

Enterobacteraerogens;blaKPC; ESBLs; AmpC β-lactamase

寧波市第一醫(yī)院檢驗科，寧波 315000 Email:54256998@qq.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.012

R378

A

1002-2694(2015)02-0148-06

2014-05-28；

2014-10-26

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金(2011KYB099)