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      錦雞兒生物活性研究

      2015-03-17 22:24:37王金梅朱曉娣連朋麗
      關(guān)鍵詞:錦雞兒正丁醇石油醚

      王金梅,陳 龍,朱曉娣,連朋麗

      (河南大學(xué)中藥研究所,河南開(kāi)封475004)

      錦雞兒生物活性研究

      王金梅,陳 龍,朱曉娣,連朋麗

      (河南大學(xué)中藥研究所,河南開(kāi)封475004)

      摘 要:目的考察錦雞兒生物活性。方法采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法對(duì)錦雞兒體外總抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),并同時(shí)測(cè)定了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性和體外抗凝血活性。結(jié)果錦雞兒具有一定的體外抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性和體外抗凝血活性,其中以乙酸乙酯部位抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)。結(jié)論錦雞兒具有潛在的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性。

      關(guān)鍵詞:錦雞兒;地上部分;抗氧化;體外α-葡萄糖苷酶抑制活性;體外抗凝血活性

      錦雞兒(Caragana sinica(Buchoz.)Rehd.)為豆科(Leguminesae)錦雞兒屬植物,常以根和花入藥,其根又名金雀花根、白心皮等,民間常用于治療虛損、勞熱咳嗽、高血壓、婦科疾患、關(guān)節(jié)炎等;花稱(chēng)金雀花,用于頭暈頭痛、耳鳴眼花、肺虛久咳、小兒疳積[1]。目前從錦雞兒屬植物中分離得到的化合物類(lèi)型包括黃酮、二苯乙烯低聚體類(lèi)、苯丙素、香豆素、萜類(lèi)和甾體等;本屬植物的藥理活性主要集中在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)錦雞兒本植物的研究較少,據(jù)報(bào)道,從錦雞兒的根中分離得到的化合物為二苯乙烯苷低聚體和異黃酮類(lèi)化合物,生物活性主要集中在抗炎、提高免疫力及刺激成骨細(xì)胞增殖的活性[3],未見(jiàn)有對(duì)錦雞兒地上部分的體外抗氧化活性、體外α-葡萄糖苷酶抑制活性、體外抗凝血活性的報(bào)道。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)錦雞兒藥用資源,我們對(duì)錦雞兒地上部分進(jìn)行了系統(tǒng)的生物活性研究。

      1 儀器、材料與試劑

      1.1儀器

      電子天平(美國(guó)Mettler-Toledo公司);UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Unico公司);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)thermo Electron公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司);DELTA 320型p H計(jì)(美國(guó)Mettler-Toledo公司);CS-H1型混合器(北京博勵(lì)陽(yáng)科技公司);96微孔板;LRH-150恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);TGL-16高速離心機(jī)(江蘇金壇中大儀器廠);各種移液器及槍頭等。

      1.2材料

      樣品于2007年10月采集于貴州省黔南州地區(qū),經(jīng)黔南民族師范學(xué)院教授郭治友教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物錦雞兒(Caragana sinica)的地上部分,標(biāo)本現(xiàn)存于河南大學(xué)中藥研究所(No.20071015)。

      1.3試劑

      2,2'-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS,美國(guó)Fluka公司),二苯代苦味?;杂苫?DPPH,日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社),6-羥基-2,5, 7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox,美國(guó)Aldrich公司),Fe3+-三吡啶三啞嗪(TPTZ,比利時(shí)Acros organics公司),丁基羥基茴香醚(BHA,比利時(shí)Acros organics公司),沒(méi)食子酸丙酯(PG,比利時(shí)Acros organics公司),二丁基羥基甲苯(BHT,比利時(shí)Acros organics公司);α-葡萄糖苷酶(Sigma公司),對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma公司),阿卡波糖(Acarbose,Sigma公司),磷酸鹽緩沖液(p H 6.8);獺兔(雄性、體重2.0~2.5 kg,由河南大學(xué)中藥研究所提供(醫(yī)動(dòng)字09―1―2號(hào)),注射生理鹽水(山東齊都藥業(yè)有限公司),注射用燈盞花素(湖南恒生制藥有限公司,20110202),維生素K1注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司,1109051);氯化鈣溶液、枸櫞酸鈉溶液,甲醇,二甲基亞砜等為分析純。

      2 實(shí)驗(yàn)部分

      2.1提取

      取錦雞兒地上部分9 kg,干燥后粉碎,加入體積分?jǐn)?shù)10 L 70%甲醇溶液室溫下冷浸3次,每次浸泡3 d。減壓回收溶劑后,過(guò)濾除去沉淀,得到甲醇總浸膏300 g。該浸膏用1.5倍體積水分散,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,回收溶劑后,分別得到石油醚部位30 g,乙酸乙酯部位180 g,正丁醇部位75 g。

      2.2抗氧化活性研究

      2.2.1DPPH方法 參照文獻(xiàn)[4],將樣品和陽(yáng)性對(duì)照品用甲醇配制成濃度為2,1,0.5,0.25,0.125, 0.062 5 g/L,取0.1 m L樣品和陽(yáng)性對(duì)照品加入3.5 m L DPPH甲醇溶液(0.06 mmol/L),混合30 min后測(cè)定515 nm處吸光度。每份樣品和陽(yáng)性對(duì)照品平行操作3次,取平均值,計(jì)算出清除率,并計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50值。

      2.2.2ABTS方法 按照文獻(xiàn)[5],配制ABTS自由基工作液。將樣品和陽(yáng)性對(duì)照品用甲醇配制成濃度為2,1,0.5,0.25,0.125,0.062 5 g/L,取0.15 m L樣品和陽(yáng)性對(duì)照品加入2.85 m L ABTS自由基工作液,混合,放置10 min后,在734 nm處測(cè)定吸光度。每份樣品和陽(yáng)性對(duì)照品平行操作3次,取平均值,計(jì)算出清除率,并計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50值。

      2.2.3FRAP方法 按照文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[7],將樣品用甲醇和陽(yáng)性對(duì)照品配制成濃度為2,1,0.5,0.25, 0.125,0.062 5 g/L,取0.2 m L樣品和陽(yáng)性對(duì)照品加入3.8 m L新鮮配制的TPTZ工作液,混勻后37℃反應(yīng)30 min后測(cè)定593 nm處吸光度,每份樣品和陽(yáng)性對(duì)照品平行操作3次。取平均值,計(jì)算出清除率,結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示。

      2.3體外抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

      參照文獻(xiàn)[8],先進(jìn)行酶活力測(cè)定,于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。同樣的方法,加入8μL DMSO溶解的樣品溶液,測(cè)定樣品的OD值。實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組,每組三孔,分別為:①對(duì)照組(緩沖液+酶液+底物);②空白組對(duì)照組(緩沖液);③樣品測(cè)定組(樣品+酶液+底物);④樣品對(duì)照組(樣品+緩沖液);⑤陽(yáng)性對(duì)照組(Acarbose+酶液+底物)。

      按照酶活性抑制率%=(OD樣品-OD樣品空白)/(OD陰性-OD空白)×100%,用Origin軟件繪制樣品濃度與抑制率曲線,求出IC50值。

      2.4體外凝血活性研究

      家兔耳緣靜脈取血3.6 m L,加至含400μL含枸櫞酸鈉溶液(38 g/L)的4m L離心管中,混勻, 1 000 r/min離心15 min,取上清液備用。取1.5 m L道夫管,樣品組加入血漿0.1 m L及樣品溶液各0.1 m L,陽(yáng)性對(duì)照組加入血漿0.1 m L及藥品溶液0.1 m L,空白組加入血漿0.1 m L及空白溶劑0.1 m L于37℃溫育1 min后分別向每管加入2.775 g/L CaCl2溶液0.1 m L,計(jì)時(shí),直到檢測(cè)到纖維蛋白絲時(shí)停止計(jì)時(shí),維生素K1、燈盞花素對(duì)照組重復(fù)3次,樣品組重復(fù)6次,求算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。結(jié)果采用算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)值統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析法(One-Way ANOVA)比較其顯著性差異。

      3 結(jié)果與討論

      3.1體外抗氧化

      半數(shù)清除率(IC50)指清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度,根據(jù)不同濃度抗氧化劑的清除率作曲線求出。按照上述方法和步驟,對(duì)錦雞兒地上部分的3種溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究,結(jié)果見(jiàn)表1。

      由表1可以看出,錦雞兒3個(gè)提取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力均較低,說(shuō)明其清除DPPH自由基的能力很差;在ABTS方法中,可以看出錦雞兒乙酸乙酯部位對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)(IC50: 7.11 g/L),強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT,其次是錦雞兒正丁醇部位,而石油醚部位無(wú)明顯清除ABTS自由基的能力;在FRAP方法中,各提取物還原Fe3+能力順序?yàn)殄\雞兒乙酸乙酯部位>錦雞兒正丁醇部位>錦雞兒石油醚部位,但差于陽(yáng)性對(duì)照。由此可以看出,錦雞兒有一定的抗氧化活性,其主要的抗氧化成分主要集中在其乙酸乙酯部位,為我們進(jìn)一步追蹤其系統(tǒng)分離其抗氧化活性成分提供了線索。

      3.2體外抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)結(jié)果

      按2.3方法,首次對(duì)錦雞兒的不同提取部位進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性研究,結(jié)果見(jiàn)表2。

      由表2可以看出,與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相比,錦雞兒各溶劑提取物均有較好的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中以錦雞兒的乙酸乙酯部位活性最好,其次為石油醚部位。

      3.3體外凝血活性研究

      錦雞兒石油醚部位、正丁醇部位對(duì)體外血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響結(jié)果,見(jiàn)表3。

      由表3可以看出,與空白組對(duì)比,錦雞兒石油醚部位和燈盞花素對(duì)體外凝血時(shí)間具有顯著性差別(P<0.001),而錦雞兒石油醚部位和燈盞花素體外凝血時(shí)間無(wú)顯著性差別(P>0.05),表明錦雞兒石油醚部位有較好的體外抗凝血作用;與空白組相比、錦雞兒正丁醇部位和維生素K1組對(duì)體外促凝血時(shí)間有顯著性差別,而正丁醇部位體外止血時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素K1(P<0.001),表示錦雞兒正丁醇部位促凝血作用明顯。

      4 結(jié)論

      我們首次對(duì)錦雞兒干燥地上部分的不同溶劑提取物進(jìn)行了采體外抗氧化、體外抑制α-葡萄糖苷酶活性和凝血活性的考察,結(jié)果表明:錦雞兒具有一定的抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、抗凝血和促凝血的作用,其中其乙酸乙酯部位的抗氧化活性和體外抑制α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)。這一結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)我們對(duì)錦雞兒乙酸乙酯部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)分離有重要的意義,并對(duì)錦雞兒資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了一定的理論支撐。

      參考文獻(xiàn):

      [1]Wu ZM.platform for new Chinese Herbal Materia Medica (Second)[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Publishing House,1991:109.

      [2]Chen L,Zhang YB,Wang JJ,et al.The progress on the chemical constitutions and pharmacological activities of Caragana.China Medi pharm,2012,2(18):9―11.

      [3]Wang SG.Studies on the Chemical Constituents and Quality Standard of Caragana sinica[D].Ph.D.Thesis of School of Pharmacy Fudan University,Shanghai:2004:(7―34).

      [4]Liu JK,Hu L,Dong ZJ,et al.DPPH radical scavenging activity of ten natural p-terphenyl derivatives obtained from three edible mushrooms indigenous to China[J]. Chem Biodiver,2004,1(2):601―605.

      [5]Kang WY,Li CF,Song YL.Antioxidant xanthones from Securidaca inappendiculata.Chin J Chin Mater Med,2008, 33(12):1 982―1 985.

      [6]Li CF,Song YL,Liu YX,et al.Antioxidant activity of extracts from Lysimachia Clethroide.Fine Chem,2008, 25(10):1 193―1 195.

      [7]Benzie I,Strain JJ.The ferric reducing ability of plasmaasa measure of“antioxidant power”:the FRAP assay [J].Anal Biochem,1996,239(1):70―76.

      [8]Tian PY,Kang WY.Studies onα-glucosidase inhibitory activities of Aeschynanthus maculatus[J].Chin J Chin-Mater Med,2012,37(19):2 910.

      [責(zé)任編輯 段金卯]

      Studies on biological activities of Caragana sinica

      WANG Jinmei,CHEN Long,ZHU Xiaodi,LIAN Pengli
      (Institute of Chinese Material Medicine,Henan University,Kaifeng 475004,China)

      Abstract:ObjectiveTo study the biological activities of Caragana sinica.MethodsThe total antioxidant activity of Caragana sinica was evaluated by three methods:DPPH radical scavenging,ABTS radical scavenging and FRAP assay,α-glucosidase inhibitory activity and anticoagulant activity in vitro were also studied.ResultsThe results showed that the ethyl acetate extract of Caragana sinica has the highest antioxidant activity andα-glucosidase inhibitory activity.ConclusionCaragana sinica has antioxidant activity andα-glucosidase inhibitory activity.

      Key words:Caragana sinica;aerial part;antioxidant activity;α-glucosidase inhibitory activity;anticoagulant activity in vitro

      作者簡(jiǎn)介:王金梅(1983―),女,碩士,講師,從事天然藥物活性成分研究工作。

      基金項(xiàng)目:河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13B360913)。

      收稿日期:2015-03-12

      中圖分類(lèi)號(hào):R285.5

      文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

      文章編號(hào):1672―7606(2015)02―0091―03

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