馮晶晶 李慧慧 孫婷婷 于 喬 王瑞妍 王 軍 (徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，徐州 221000)

巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)普遍存在于自然界，一旦侵入機(jī)體將終生攜帶。CMV 為機(jī)會(huì)性致病原，主要對(duì)免疫低下或缺陷者:如嬰幼兒、新生兒、胎兒等產(chǎn)生危害，可導(dǎo)致全身播散性感染，且感染易形成持續(xù)及慢性化發(fā)展［1］，其原因尚不明確。近年來新發(fā)現(xiàn)的Th17 細(xì)胞來源于CD4+T 細(xì)胞，Th17/Treg 細(xì)胞平衡的作用廣受關(guān)注，研究表明此平衡的打破與炎癥性疾病、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。維甲酸相關(guān)孤兒核受體(RORγt)是Th17 細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，分布于淋巴細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)IL-17 的分泌。我們前期研究表明，在鼠巨細(xì)胞病毒(Murine cytomegalovirus，MCMV)肝炎新生鼠中IL-17、IL-23 呈現(xiàn)高表達(dá)，提示Th17 細(xì)胞可能參與MCMV 肝炎的發(fā)病［3］，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)從Th17 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子入手，采用RT-PCR 及Western blot 方法測定MCMV 新生鼠脾臟內(nèi)RORγt及IL-17 的表達(dá)，為巨細(xì)胞病毒感染的發(fā)病機(jī)制及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3細(xì)胞)引自江蘇省南京醫(yī)科大學(xué)兒科實(shí)驗(yàn)室，MCMV Smith 株由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所友情提供，3T3 細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，病毒致半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)=104.31/0.1 ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及分組 48 只健康BALB/c新生鼠隨機(jī)分成病毒組(C 組)和對(duì)照組(V組)。病毒組按照文獻(xiàn)［4］制備巨細(xì)胞病毒感染模型，對(duì)照組于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腹腔注射等量無菌生理鹽水，造模后第3、7、14 天處死小鼠，無菌法取脾臟組織，分置于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 檢測 采用蛋白酶K 裂解法提取脾臟組織DNA 進(jìn)行MCMV DNA PCR 檢測，同時(shí)用RTPCR 法檢測小鼠脾臟IL-17 mRNA，RORγt mRNA，反應(yīng)體系:DNA 模板(脾臟提取)2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，Taq 酶12.5 μl，dd H2O 8.5 μl，共25 μl;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;然后執(zhí)行35個(gè)循環(huán):94℃變性30 s，各目的基因的退火溫度見表1，退火30 s，72℃延伸40 s;最后72℃總延伸5 min。電泳條件:100 mV 電泳40 min 以S1000 Thermal-Cycler PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以GIS-2008 型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

1.4 Western blot 檢測法測定脾臟組織中RORγt 蛋白表達(dá)水平 SDS-PAGE 結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)的方法將凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至NC 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，將NC 膜分別與兔抗小鼠RORγt(1∶500)和β-actin(1∶1 000)多克隆抗體4℃孵育過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體(1∶1 000)室溫孵育4 h，加入底物BCIP/NBP 混合液顯色。

2 結(jié)果

2.1 各組各時(shí)點(diǎn)脾臟組織中MCMV-DNA 的表達(dá)如圖1 所示，病毒組感染后3 d 即出現(xiàn)陽性條帶，說明存在巨細(xì)胞病毒DNA 表達(dá)，且隨著感染時(shí)間的延長，其表達(dá)越來越多，而對(duì)照組則未出現(xiàn)陽性條帶。

2.2 脾臟組織中RORγt 蛋白的表達(dá) 如圖2，Western blot 分析顯示，在蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為57及43 kD 處可見特異性陽性條帶，分別是RORγt及β-actin 蛋白表達(dá)。病毒組脾臟組織中的RORγt蛋白表達(dá)較對(duì)照組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)明顯增加(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且第14 天時(shí)表達(dá)量最高(見表2)。

圖1 MCMV 感染小鼠各時(shí)點(diǎn)脾臟MCMV DNA 電泳圖Fig.1 MCMV DNA electrophoresis of different periods MCMV infection of spleen in newborn mice

表1 MCMV，IL-17，RORγt，GAPDH 及β-actin 引物序列Tab.1 Primer sequence of MCMV，IL-17，RORγt，GAPDH and β-actin

表2 不同時(shí)間點(diǎn)脾臟組織RORγt 蛋白表達(dá)量(n=8，±s)Tab.2 Expression of RORγt protein in spleen of newborn mice(n=8，±s)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)脾臟組織RORγt 蛋白表達(dá)量(n=8，±s)Tab.2 Expression of RORγt protein in spleen of newborn mice(n=8，±s)

Note:Viral group compared with the control group in the corresp-onding point.

圖2 脾臟RORγt 蛋白表達(dá)的Weston blot 分析Fig.2 Images of RORγt protein production in spleen of newborn mice

圖3 各組新生鼠脾臟RORγt mRNA 電泳圖Fig.3 Images of RORγt mRNA production in spleen of newborn mice

圖4 各組新生鼠脾臟IL-17 mRNA 電泳圖Fig.4 Images of IL-17 mRNA production in spleen of newborn mice

表3 小鼠脾臟組織RORγt mRNA、IL-17 mRNA 相對(duì)灰度值(n=8，±s)Tab.3 Expression of RORγt mRNA，IL-17 mRNA in spleen of newborn mice(n=8，±s)

表3 小鼠脾臟組織RORγt mRNA、IL-17 mRNA 相對(duì)灰度值(n=8，±s)Tab.3 Expression of RORγt mRNA，IL-17 mRNA in spleen of newborn mice(n=8，±s)

Note:Viral group compared with the control group in the corresponding point.

2.3 脾組織RORγt mRNA、IL-17 mRNA 表達(dá)水平變化(見表3，圖3、4) 病毒組小鼠自感染第3d 脾臟組織中RORγt mRNA、IL-17 mRNA 表達(dá)水平均開始升高，至第7 天維持較高水平，直至第14 天達(dá)到峰值，且第7、14 天時(shí)表達(dá)量均高于對(duì)照組，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)RORγt mRNA、IL-17 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

持續(xù)病毒感染造成的機(jī)體慢性感染性疾病是目前廣受關(guān)注的世界性問題，而持續(xù)反復(fù)感染造成的機(jī)體慢性損傷與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Th17 細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)T 細(xì)胞亞群，主要由CD4+T 淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，以分泌IL-17 因子為特征而不同于傳統(tǒng)的Th1 和Th2 細(xì)胞［5］。IL-17 參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在調(diào)節(jié)自身免疫及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和防御病原菌感染方面起著不可替代的作用。IL-17 通過上調(diào)凋亡分子表達(dá)來抑制病毒感染細(xì)胞的凋亡，并抑制細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，從而降低其清除病毒的能力。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在巨細(xì)胞病毒感染新生鼠體內(nèi)，隨著感染時(shí)間的延長，其MCMV-DNA表達(dá)量逐漸升高，而IL-17mRNA 的表達(dá)量變化與巨細(xì)胞病毒量具有明顯的相關(guān)性，我們推測病毒的不斷復(fù)制與IL-17 高表達(dá)引起的免疫功能失衡有關(guān)。

RORγt 是維甲酸相關(guān)孤兒核受體家族成員之一，表達(dá)于Th17 等細(xì)胞內(nèi)，受STAT-3 的調(diào)控［6］，它可引起IL-17A-IL-17F 基因座的染色質(zhì)重塑，從而開放IL-17 的基因座位，并可直接結(jié)合到IL-17 啟動(dòng)子的ROR 反應(yīng)原件上，誘導(dǎo)初始Th 細(xì)胞中的IL-17基因轉(zhuǎn)錄，在低濃度的IL-6 與TGF-β 協(xié)同作用下誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞的生成。有研究表明，在初始T 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入編碼RORγt 的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以誘導(dǎo)其分化為Th17 細(xì)胞，分泌IL-17，相反在RORγt 基因敲除的小鼠中Th17 細(xì)胞分化嚴(yán)重受損［7］，這證明了RORγt 在Th17 細(xì)胞分化中的重要作用。

本研究為探討RORγt、IL-17 與鼠巨細(xì)胞病毒感染的關(guān)系，應(yīng)用RT-PCR 法分析了MCMV 感染新生鼠與正常新生鼠脾臟組織中RORγt mRNA、IL-17mRNA 表達(dá)的差異，并進(jìn)一步采用Western blot 法檢測兩組新生鼠脾臟中RORγt 蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，IL-17mRNA、RORγt mRNA 及蛋白在病毒組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，且其表達(dá)在注射病毒后第14 天達(dá)到最高水平，這提示在巨細(xì)胞病毒感染急性期，尤其是在病毒血癥期，病毒可以刺激脾臟組織中的單核巨噬細(xì)胞等分泌大量的炎癥因子，如:IL-6、TGB-β，在炎癥因子的協(xié)同作用下，引起CD4+T 細(xì)胞內(nèi)RORγt 基因和蛋白高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)初始T 淋巴細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化，除此之外，RORγt 還可以誘導(dǎo)IL-23 受體表達(dá)，維持Th17 細(xì)胞的存活并促進(jìn)其增殖［7］，Th 細(xì)胞大量產(chǎn)生，分泌大量IL-17，后者與中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞等炎性細(xì)胞表面的IL-17 受體結(jié)合后，使其釋放各種趨化因子、炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞聚集至炎癥部位［8］，引起脾臟的病理損傷。

Th17 與巨細(xì)胞病毒的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，通過抑制Th17 的分化可以減少巨細(xì)胞病毒的復(fù)制，而針對(duì)Th17 細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt 的干預(yù)手段將有可能抑制Th17 細(xì)胞，尋找RORγt 抑制劑可能成為治療巨細(xì)胞病毒新靶點(diǎn)。

［1］劉玲玲，李旭芳，秦文卿，等.IL-17A 參與巨細(xì)胞病毒感染后脾臟病理改變的機(jī)制研究［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33(3):188-192.

［2］Almolda B，Costa M，Montoya M，et al.Increase in Th17 and T-reg lymphocytes and decrease of IL22 correlate with the recovery phase of acute EAE IN rat［J］.PloS One，2011，6(11):e27473.

［3］張恩勝，王 軍，萬雪媛，等.Th17 相關(guān)性細(xì)胞因子在新生小鼠MCMV 肝炎中的表達(dá)及意義［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29(1):57-61.

［4］張恩勝，王 靜，王 軍，等.新生小鼠巨細(xì)胞病毒肝炎模型的建立［J］.中國新生兒科雜志，2013，28(5):339-342.

［5］劉高勤，吳鴻雅，張光波，等.人重組IL-17/His 蛋白的原核表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23(8):715-718.

［6］Yang XO，Panopoulos AD，Nurieva R，et al.STAT3 regulates cytokine-mediated generation of inflammatory helper T cells.［J］.J Biol Chem，2007，282(13):9358-9363.

［7］Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L.The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells［J］.Cell，2006，126(06):1121-1133.

［8］胡斯明，羅雅玲，賴文巖，等.哮喘小鼠肺組織中轉(zhuǎn)錄因子RORγt 的表達(dá)與氣道炎癥的關(guān)系［J］.中國免疫學(xué)雜志，2009，25(4):364-368.