丁福鵬 戚長(zhǎng)林 高 輝 劉易軍 王 井 單玉興 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院分院骨科，長(zhǎng)春 130021)

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死是以漸進(jìn)性股骨頭塌陷為特征的嚴(yán)重的慢性疾?。?］，疾病早期進(jìn)展隱匿沒有明顯的臨床癥狀，后期只能通過人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療來緩解癥狀和恢復(fù)功能，但是該手術(shù)給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并帶有長(zhǎng)期的并發(fā)癥。非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制并不明確，但飲酒是公認(rèn)的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要病因之一，酒精可能通過加重血管內(nèi)凝血進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)缺血和壞死，但其具體機(jī)制并不明確［2，3］。濾泡輔助性T 細(xì)胞(Tfh)是最近發(fā)現(xiàn)的對(duì)B 細(xì)胞的分化、抗體生產(chǎn)和體液免疫具有重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，Tfh細(xì)胞表面表達(dá)趨化因子受體5(CXCR5)，可誘導(dǎo)輔助刺激因子(ICOS)和程序性死亡因子(PD)-1 并以分泌IL-21 為特征［4］，本研究通過分析酒精性股骨頭壞死患者外周血中Tfh 細(xì)胞和B 細(xì)胞的變化情況，來探究Tfh-B 細(xì)胞間相互作用在酒精性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 26 例酒精性股骨頭壞死患者來自吉林大學(xué)第一醫(yī)院住院部及門診，其中男性24 例，女性2 例，年齡49(40～70)歲;選取15 名健康者作為健康對(duì)照組，男性12 名，女性3 名，年齡48(36～68)歲。病例組和健康對(duì)照組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷均符合Mont 提議的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，患者酗酒超過十年，每日飲白酒量大于0.25 kg/dof，病人的疾病等級(jí)分期參照FICAT 分期標(biāo)準(zhǔn)［6］，股骨頭塌陷指數(shù)參照Deng JC 提出的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)［7］。排除創(chuàng)傷性股骨頭壞死、骨腫瘤、強(qiáng)直性脊柱炎、先天髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良、髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、自身免疫性疾病及近期感染的患者。本研究符合中國醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)，并獲得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。標(biāo)本采集均取得受試者的知情同意。

1.2 外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離 治療前靜脈抽取新鮮全血(枸櫞酸鈉抗凝)6 ml，通過梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，在含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液(Hyclone，Waltham，MA，USA)中培養(yǎng)PBMCs，加入50 ng/ml phorbol myristate acetate(PMA)和2 g/ml 離子霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)刺激1 h，加入布雷菲德菌素A(10 g/ml，GolgiStop，BD Sciences，San Jose，CA，USA)培養(yǎng)5 h，收集調(diào)成細(xì)胞數(shù)約為1 ×107ml-1的懸液備用。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tfh 細(xì)胞 分離后PBMCs 加入Alexa Fluor 647 抗CXCR5 抗體，藻紅蛋白(PE)/CY7 抗CD4 抗體，PE 抗CD278 抗體，和異硫氰酸熒光素(FITC)抗CD279 抗體(BD PharMingen，San Diego，CA，USA)在室溫下避光染色30 min。同型對(duì)照組加入FITC 抗IgG1 抗體，PE 抗IgG1 抗體，PE/CY7 抗IgG1 抗體和Alexa Fluor 647 抗IgG1 抗體(BD PharMingen)。收集刺激后的PBMCs，加入Alexa Fluor 647 抗CXCR5 抗體，PE/CY7 抗CD4 抗體在室溫下避光染色30 min，固定破膜后PE 抗IL-21抗體胞內(nèi)染色。流式細(xì)胞檢測(cè)分析IL-21+Tfh 細(xì)胞比率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B 細(xì)胞 分離后PBMCs 加入多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)抗CD19 抗體，F(xiàn)ITC-抗CD86 抗體，PE-抗CD27 抗體，別藻藍(lán)蛋白(APC)抗CD95 抗體(BD PharMingen)在室溫下避光染色30 min，同型對(duì)照組加入FITC-IgG1 抗體，PE 抗Ig2a 抗體，PerCP 抗IgG1 抗體，和APC 抗IgG1 抗體(BD PharMingen)染色。選取CD4+細(xì)胞設(shè)門，F(xiàn)lowJo 軟件(v7.6.2)分析樣本中不同亞群CD19+B 細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 細(xì)胞因子測(cè)定 嚴(yán)格按照人IL-21 ELISA 試劑盒(Roche Diagnostics，Lewes，UK)說明書檢測(cè)外周血中IL-21 濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用中值及其范圍表示，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 秩和相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酒精性股骨頭壞死中不同B 細(xì)胞亞群的變化情況及其與疾病進(jìn)展的相關(guān)性 酒精性股骨頭壞死患者外周血CD19+B 細(xì)胞百分率顯著高于健康對(duì)照組(圖1B;t=3.765，P=0.000 5)，分析B 細(xì)胞不同亞群在酒精性股骨頭壞死中的變化情況，發(fā)現(xiàn)CD27+CD19+B 細(xì)胞相對(duì)于健康對(duì)照組明顯減少(圖1C;t=3.027，P=0.004)，CD86+CD19+B 細(xì)胞和CD96+CD19+B 細(xì)胞百分率顯著高于健康對(duì)照組(圖1D、E;t=5.506，P ＜0.000 1;t=4.152，P=0.000 2)，相關(guān)性分析顯示CD86+CD19+B 細(xì)胞百分率與股骨頭壞死評(píng)分呈正相關(guān)(圖1F;P ＜0.000 1，r=0.536)。

2.2 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細(xì)胞亞群和血清IL-21 水平的變化情況 酒精性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細(xì)胞百分率顯著高于健康對(duì)照組(圖2B;t=7.611，P ＜0.000 1)，同時(shí)PD-1+Tfh 細(xì)胞和IL-21+Tfh 細(xì)胞百分率顯著高于健康對(duì)照組(圖2C、E;t=4.369，P ＜0.000 1;t=0.989，P ＜0.000 1)，然而患者及健康對(duì)照組間比較ICOS+Tfh 細(xì)胞百分率并無顯著變化(圖2D;t=0.989，P=0.328)，患者血清IL-21 水平明顯高于健康人(圖2F;t=23.03，P ＜0.000 1)。

2.3 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細(xì)胞亞群的變化情況與不同B 細(xì)胞亞群的變化情況的相關(guān)性相關(guān)性分析顯示，酒精性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細(xì)胞百分率與CD19+B 細(xì)胞百分率呈正相關(guān)(圖3A;P=0.000 2，r=0.455)，外周血IL-21+Tfh細(xì)胞百分率與CD86+CD19+B 細(xì)胞百分率呈正相關(guān)(圖3B;P=0.000 2，r=0.447)。

圖1 酒精性股骨頭壞死中不同B 細(xì)胞亞群的變化情況及其與疾病進(jìn)展的相關(guān)性分析Fig.1 Analysis of different subsets of B cells between NONFH patients and HC，and correlation between B cells and indices of femoral head collapse

圖2 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細(xì)胞亞群和血清IL-21 水平的分析Fig.2 Analysis of different subsets of Tfh cells and serum IL-21 levels between NONFH patients and HC

圖3 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細(xì)胞亞群與不同B 細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析Fig.3 Correlations between different subsets of Tfh cells and CD19 +B cells

3 討論

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死是臨床上常見的慢性疾病，發(fā)病機(jī)制不清且致病因素復(fù)雜。眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者中存在免疫失衡的現(xiàn)象，免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等易并發(fā)股骨頭壞死［8，9］，外周血升高的細(xì)胞因子被證明與股骨頭的破壞有關(guān)，抗磷脂抗體和抗心脂抗體也被發(fā)現(xiàn)參與股骨頭壞死的發(fā)病及進(jìn)展。飲酒是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要病因之一，Okazak 等［10］在研究酒精性骨壞死時(shí)發(fā)現(xiàn)酒精濫用通過LPS 相關(guān)通路誘導(dǎo)IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、IFN-γ 和TNF-α 的分泌，從而導(dǎo)致股骨頭的破壞，同樣有研究證明酒精濫用可通過Toll 樣受體4(TLR4)通路引起系統(tǒng)性的炎癥［11］。眾所周知，LPS 通過TLR4 對(duì)B 細(xì)胞具有激活作用［12］?？梢夿 細(xì)胞可能參與酒精性非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病及進(jìn)展。

我們的研究發(fā)現(xiàn)酒精性非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者外周血CD19+B 細(xì)胞顯著高于健康對(duì)照組，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)患者外周血CD95+CD19+B 細(xì)胞和CD86+CD19+B 細(xì)胞百分率相對(duì)于健康對(duì)照組顯著增高，然而患者外周血CD27+CD19+記憶性B 細(xì)胞顯著減少。有研究者證明CD27+B 細(xì)胞易在活化B細(xì)胞的刺激下分化為漿細(xì)胞［13］，這與我們的發(fā)現(xiàn)相符，在酒精性股骨頭壞死的病理狀態(tài)下，記憶性B細(xì)胞可能再次活化分化為漿細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)CD27+CD19+記憶性B 細(xì)胞的減少。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在酒精性股骨頭壞死患者中CD86+CD19+B 細(xì)胞與股骨頭塌陷指數(shù)呈正相關(guān)，這說明B 細(xì)胞在酒精性股骨頭壞死發(fā)病及發(fā)展中具有重要的作用。

Tfh 細(xì)胞是最近發(fā)現(xiàn)的對(duì)B 細(xì)胞的分化、抗體生產(chǎn)和體液免疫具有重要調(diào)節(jié)作用的CD4+T 細(xì)胞，Tfh 細(xì)胞通過表面表達(dá)的CXCR5、PD-1 和ICOS 調(diào)節(jié)生發(fā)中心中B 細(xì)胞的活化［14］，同時(shí)Tfh 細(xì)胞可分泌IL-21。IL-21 參與Tfh 細(xì)胞的產(chǎn)生分化和細(xì)胞增殖，并在生發(fā)中心形成及免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要作用［15］。有研究者發(fā)現(xiàn)Tfh 細(xì)胞和IL-21 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞中發(fā)揮著重要的作用［16，17］。本研究發(fā)現(xiàn)酒精性非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細(xì)胞顯著高于健康對(duì)照組，且PD-1+Tfh 細(xì)胞和IL-21+Tfh 細(xì)胞百分率顯著高于健康對(duì)照組，然而患者及健康對(duì)照組間比較ICOS+Tfh 細(xì)胞百分率并無顯著變化。過去的研究證明免疫的失衡在NONFH 的疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要的角色，升高的Tfh 細(xì)胞可能也參與酒精性股頭壞死進(jìn)展。為了更好地探究Tfh 細(xì)胞在酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用，我們進(jìn)一步分析了酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細(xì)胞亞群的變化情況與不同B 細(xì)胞亞群的變化情況的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)酒精性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細(xì)胞百分率與CD19+B 細(xì)胞百分率呈正相關(guān)，IL-21+Tfh 細(xì)胞百分率與CD86+CD19+B 細(xì)胞百分率呈正相關(guān)，這提示Tfh 細(xì)胞通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌和B 細(xì)胞的活化參與酒精性股骨頭壞死的發(fā)病及進(jìn)展。

過量的酒精攝入造成體外循環(huán)的炎癥狀態(tài)［10］，Tfh 細(xì)胞數(shù)目增高并分泌大量IL-21，誘導(dǎo)B 細(xì)胞的活化，Tfh-B 細(xì)胞相互作用導(dǎo)致患者體內(nèi)免疫失衡。Kwok［18］發(fā)現(xiàn)IL-21 不僅上調(diào)RANKL(核因子κ B受體活化因子配體)的表達(dá)，而且可以在缺乏RANKL 的情況下誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化，B 細(xì)胞也表達(dá)RANKL［19］。眾所周知，體內(nèi)升高的RANKL，會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞的激活，從而引發(fā)骨壞死，從而加重股骨頭壞死。Tfh-B 細(xì)胞可能在酒精性股骨頭壞死的發(fā)病和發(fā)展過程中具有重要的作用。

綜上所述，酒精性股骨頭壞死患者體內(nèi)Tfh 細(xì)胞和B 細(xì)胞均高于健康對(duì)照組，并且Tfh 細(xì)胞與B細(xì)胞在疾病的發(fā)展過程中相互作用，可能在酒精性股骨頭壞死的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，然而Tfh-B 細(xì)胞在酒精性股骨頭壞死疾病中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，對(duì)Tfh-B 細(xì)胞的相互作用進(jìn)一步的研究對(duì)控制和治療酒精性股骨頭壞死具有重要意義。

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