草魚出血病及其疫苗研究進(jìn)展

王強(qiáng)+汪開(kāi)毓

摘 要 草魚（Grass carp）是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，養(yǎng)殖范圍廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。但在草魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)過(guò)程中，易發(fā)生各種疾病，給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。其中，草魚出血病是影響草魚養(yǎng)殖的重要疾病之一，其病原為草魚呼腸孤病毒。對(duì)于該病國(guó)內(nèi)目前對(duì)其做了大量研究，化學(xué)藥物難以達(dá)到治療目的而免疫技術(shù)在該疾病的防治上取得了一定成就?；诖?，首先總結(jié)了近年來(lái)關(guān)于草魚出血病的研究，著重闡述草魚出血病的病原生物學(xué)特征以及流行病學(xué)相關(guān)情況；而后就國(guó)內(nèi)目前草魚出血病疫苗研究情況做一介紹并提出該病防治的新展望。

關(guān)鍵詞 草魚出血病；草魚呼腸孤病毒；流行病學(xué)；疫苗

中圖分類號(hào)：S941.41+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2014）12--4

草魚（Grass carp）屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，草魚屬。一般喜居于水的中下層和近岸多水草區(qū)域，性活潑，游泳迅速，為典型的草食性魚類。因其生長(zhǎng)迅速，飼料來(lái)源廣，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一。但是在草魚飼養(yǎng)過(guò)程中易發(fā)生各種疾病，其中草魚出血病是一種最為常見(jiàn)的草魚疾病，這種疾病嚴(yán)重應(yīng)先我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。早在20世紀(jì)70年代我國(guó)就開(kāi)始研究草魚出血病，80年代發(fā)現(xiàn)草魚出血病病源——病毒顆粒[2-3]，90年代初國(guó)際病毒分類委員會(huì)將草魚出血病病源命名為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）[4]。草魚出血病病毒主要侵染草魚的內(nèi)臟組織，而化學(xué)藥物難以達(dá)到治療目的，目前仍然沒(méi)有找到一種效果良好的特效藥。但是，從免疫系統(tǒng)角度出發(fā)研究此病，能夠在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病方面取得一些進(jìn)展[5]。隨著生物制劑技術(shù)的發(fā)展，免疫接種疫苗能夠有效地減少疾病的發(fā)生。故探討草魚出血病流行病學(xué)特征以及草魚出血病疫苗的研制情況對(duì)于草魚出血病的預(yù)防，減少草魚養(yǎng)殖業(yè)中的經(jīng)濟(jì)損失非常重要。

1 出血病病毒生物特性

草魚出血病病毒（Grass Carp Haemorrhage Virus，GCHV）是水生呼腸孤病毒，隸屬呼腸孤病毒科，水生動(dòng)物呼腸孤病毒屬，因此又稱為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）。病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)與正呼腸孤病毒相似，隨著科技的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步以及計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)、三維技術(shù)的提高，病毒研究工作也得到了有效的進(jìn)展。方勤等[7]對(duì)該病毒的衣殼蛋白特性和三維重構(gòu)研究，研究結(jié)果顯示：GCRV顆粒排列在RNA核心與內(nèi)/中/外殼層，呈現(xiàn)多層排列的特點(diǎn)。病毒的外衣殼是由200個(gè)按T=13對(duì)稱排列的三聚體構(gòu)構(gòu)成。該病毒排列的特點(diǎn)是在5次軸上出現(xiàn)三聚體缺失凹陷區(qū)，三聚體亞單位暴露出中間層，而內(nèi)殼層由T=1排列的120個(gè)病毒單體組成。

此病毒基因組為雙股RNA，由11個(gè)片段組成，核酸的總分子質(zhì)量為1.55×107u[8]。該病毒完整的病毒粒子在氯化銫（CsCl）一定的密度梯度離心浮力密度、蔗糖梯度離心以及沉降系數(shù)等狀態(tài)下呈現(xiàn)出一定的形式，對(duì)熱（56 ℃，1 h）穩(wěn)定，而在65 ℃，1 h完全失活[9]。病毒對(duì)類脂溶解（如氯仿）不敏感，對(duì)酸（pH=3）、堿（pH=10）處理不敏感。經(jīng)酸處理后，毒力增強(qiáng)，滴度提高，另外，此病毒毒性的提高還與草魚體內(nèi)精氨酸和胰蛋白酶量增加有關(guān)[10]。

GCRV不僅能在草魚自身體內(nèi)繁殖，而且具有遺傳性，它能夠在草魚體內(nèi)產(chǎn)生合胞體狀細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）[11]。此病毒可在GCO、GCK、CIK、ZC-7901、PSF以及GCF等草魚細(xì)胞株內(nèi)增殖。胞漿內(nèi)的病毒呈晶格狀排列，在溫度為28 ℃時(shí)復(fù)制速度最快，一般情況下，草魚在此溫度環(huán)境下感染病毒12 h以后病毒就開(kāi)始復(fù)制，24～27 h以后病毒開(kāi)始大量繁殖，侵害操于體內(nèi)的正常細(xì)胞，使之病化，細(xì)胞標(biāo)體會(huì)出現(xiàn)2 mm長(zhǎng)的空斑[12]，這種表象是草魚細(xì)胞受感染的重要標(biāo)志。

2 草魚出血病病毒致病機(jī)理分析

病理組織學(xué)觀察，可見(jiàn)全身毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管壁通透性增高引起毛細(xì)血管或小血管出血以及形成血栓。由于血液循環(huán)的障礙，導(dǎo)致全身各臟器組織不同程度的變性壞死。血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示，紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血紅蛋白顯著低于健康魚，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（SGPT）、血清乳酸脫氫酶（SLDH）及血清異檸檬酸脫氫酶（SIDH）活性增高。在某些感染魚中，乳酸脫氫酶（SLDH）紊亂，SLDH明顯多出一條區(qū)帶[13]。血漿總蛋白、血清總蛋白、尿素氮、膽固醇降低。

草魚出血病毒的危害主要是通過(guò)破壞草魚循環(huán)系統(tǒng)，減弱草魚血管凝血作用，導(dǎo)致操于體內(nèi)血清乳酸脫氫酶相對(duì)活性的紊亂，這時(shí)草魚的生理功能失調(diào)，最終各種疾病。此病毒能夠破壞草魚的血液系統(tǒng)降低草魚的血液緩沖系統(tǒng)功能，草魚體內(nèi)生成大量的固定酸，這些固定酸又不能被及時(shí)代謝出去，導(dǎo)致草魚腸道發(fā)生病變，減弱其腸道功能，導(dǎo)致草魚體內(nèi)出現(xiàn)酸中毒。在多種因素的共同作用下，操于體內(nèi)的一些酶活性受到抑制，導(dǎo)致草魚一些臟器系統(tǒng)法和免疫系統(tǒng)受到較大的影響，比如草魚體內(nèi)皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞減少、壞死等。

3 草魚出血病臨床癥狀

草魚出血病是一種危害性比較大的疾病類型，此病的主要臨床癥狀：初期草魚會(huì)有不同程度的食欲不振、頭部發(fā)黑，或者草魚背部出現(xiàn)淺白色條帶；隨著病情的加重草魚會(huì)出現(xiàn)不同部位的出血癥狀，出血的部位包括頭部、口腔、上下頜、鰓蓋以及腹部等部位，有時(shí)也可能表現(xiàn)為眼球突出甚至出現(xiàn)全身肌肉呈鮮紅色、腸壁充血等癥狀[15]；由于魚體嚴(yán)重出血，導(dǎo)致貧血的發(fā)生，此時(shí)鰓絲通常呈灰白色。出血嚴(yán)重時(shí)，病魚因貧血而使得血液顏色變淡，血量明顯不足，部分臟器顏色也變淡。

以上描述的癥狀主要以出血現(xiàn)象為主，但在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)病魚的癥狀并不是上述所有癥狀都會(huì)出現(xiàn)，每一條魚的癥狀也各有不同，有時(shí)可同時(shí)出現(xiàn)兩種，不能將它們絕對(duì)地分開(kāi)，它們之間可同時(shí)混合發(fā)生。根據(jù)中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所長(zhǎng)期的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病魚的主要癥狀可大致劃分為以下三種類型：endprint

紅肌肉型：出現(xiàn)這種癥狀的病魚外表沒(méi)有明顯的出血癥狀，即便有出血癥狀也比較輕微，一般病魚肌肉呈點(diǎn)狀或斑塊狀出血，嚴(yán)重時(shí)全身肌肉呈鮮紅色。因失血過(guò)多，鰓絲呈灰白色，此類癥狀一般發(fā)生在較小的草魚身上。

紅鰭紅鰓蓋型：這種類型的癥狀一般以體表出血為主，草魚的鰓蓋、口腔、上下頜以及眼部周圍能夠看出有明顯的充血、出血現(xiàn)象，此類癥狀一般發(fā)生在較大（13 cm以上）的魚種中出現(xiàn)。

腸炎型：病魚以腸道充血、出血為主，體表及肌肉出血不明顯。嚴(yán)重時(shí)可見(jiàn)腸道呈鮮紅色，腸系膜脂肪和鰾可見(jiàn)點(diǎn)狀出血。這種類型一般在大小草魚上都可見(jiàn)到。

4 草魚出血病的流行病學(xué)特征

草魚出血病之所以那么嚴(yán)重，除了其自毒性比較大以外，還有它具有較強(qiáng)的傳染性，該病一旦流行，傳播速度比較快，而且發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)，有具有較高的發(fā)病率?？稍斐刹蒴~魚種的大量發(fā)病死亡，造成嚴(yán)重的損失。可使2.5～15 cm大小的草魚發(fā)病，以7～10 cm當(dāng)年草魚種最為普遍，有時(shí)也可使2齡以上的大草魚發(fā)病。本病發(fā)病率高，死亡率也高，可達(dá)70%～80%以上，造成大量草魚種死亡。流行季節(jié)在6月下旬至9月底，8月為流行高峰期。一般發(fā)病水溫在20～33 ℃，最適發(fā)病溫度為27～30 ℃。健康草魚感染此病毒以后，一般在4～15 d內(nèi)發(fā)病死亡，該病病情進(jìn)展有3個(gè)階段，潛伏期、前趨期和發(fā)展期[15]。該病毒也可感染青魚、麥穗魚，其它魚未見(jiàn)感染報(bào)道。

20世紀(jì)50年代初，倪達(dá)書等[16]專家就發(fā)現(xiàn)草魚出血病伴有出血癥狀，懷疑草魚出血病是一種病毒性疾病。而最早發(fā)現(xiàn)草魚出血病是在20世紀(jì)70年代的湖北某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，當(dāng)時(shí)在湖北、兩廣、江浙等地區(qū)非常流行[1]。對(duì)于我國(guó)草魚出血病的流行情況，陳艷[17]依據(jù)2001年和2002年全國(guó)草魚出血病病情月報(bào)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，草魚出血病主要流行地區(qū)為江西、安徽、廣西福建天津等地區(qū)。研究結(jié)果顯示草魚出血病一年有兩次死亡高峰期，這兩次死亡高峰期分別是每年的7月和9月。草魚病的流行特征在不同地域有相同的流行特點(diǎn)，但是也有一些不同的流行特點(diǎn)，這可能與不同地區(qū)自然環(huán)境不同有關(guān)。而且同地方的同一疾病，在不同流行年份流行特征也有所不同，所以，草魚病的防治結(jié)合各個(gè)地區(qū)自然環(huán)境特點(diǎn)等因素進(jìn)行綜合考慮，總結(jié)出發(fā)病規(guī)律，以便更好開(kāi)展防治工作。

5 草魚出血病疫苗研究進(jìn)展

草魚出血病引起草魚魚種大規(guī)模的發(fā)病，導(dǎo)致魚種大量死亡，對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)所造成的損失是不可估量的。根據(jù)人類醫(yī)學(xué)研究表明，病毒病一直是很難通過(guò)藥物起到治療效果，對(duì)于草魚出血病更是無(wú)有效的藥物進(jìn)行治療。因此，預(yù)防該病的發(fā)生顯得尤為重要，近幾年，草魚病的防治重點(diǎn)一直在免疫疫苗的研究。免疫疫苗的防治主要是通過(guò)對(duì)草魚出血病進(jìn)行滅活疫苗、減毒疫苗的分析與研究，發(fā)揮其免疫效果作用。而且隨著生物學(xué)的發(fā)展，疫苗免疫保護(hù)效果的研究越來(lái)越完善[18]。下面對(duì)上述幾種疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)以及免疫保護(hù)效果作簡(jiǎn)要的評(píng)價(jià)。

5.1 滅活疫苗

滅活疫苗的主要機(jī)理是利用某種高科技方法滅活草魚病原體的感染性蛋白[19]，如利用滅活劑或者加熱處理方式在不改變草魚原有免疫系統(tǒng)功能的情況下殺死草魚活病原微生物。其優(yōu)點(diǎn)是研制周期短，制備方便，使用安全，易于保存。其缺點(diǎn)是需要有大量的病毒基礎(chǔ)才能引起免疫應(yīng)答作用。而大量病毒又可能引起草魚局部或全身的不良反應(yīng)[20]；另外，該疫苗由于不能進(jìn)入MHC I類抗原呈遞途徑，所以在實(shí)際使用過(guò)程中也很難達(dá)到消耗的效果，即便有較好的效果，但是效果比較短暫[21]。

5.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過(guò)化學(xué)或物理的方法，使得病原體的毒力單位活性減低，但又不丟失其具有免疫原性的一類疫苗，通常具有較好的免疫原。優(yōu)點(diǎn)是該病毒的繁殖能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)行，這樣就減少了在草魚體內(nèi)注佐劑的環(huán)節(jié)，不會(huì)影響草魚肉的品質(zhì)，而且此疫苗免疫期比較長(zhǎng)。缺點(diǎn)是在使用此種免疫疫苗進(jìn)行處理過(guò)程中存在一定的致病性，如果刺激性過(guò)強(qiáng)會(huì)有一定程度的潛在危險(xiǎn)性；同時(shí)，這種活疫苗的生產(chǎn)對(duì)周圍環(huán)境有一定的影響；而且這種免疫疫苗不便于儲(chǔ)存，保質(zhì)期比較短，一般情況下需要凍干保存。所以這種免疫疫苗應(yīng)用成本比較高，影響其在發(fā)展中國(guó)家的推廣應(yīng)用。許淑英等[20]對(duì)該疫苗進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示，此類疫苗的應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)100%草魚成活率和免疫保護(hù)率。

5.3 基因工程疫苗

此類免疫疫苗主要是通過(guò)重組草魚DNA進(jìn)行的治療，DNA重組技術(shù)應(yīng)用于草魚身上能夠使草魚產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)抗原。在醫(yī)學(xué)上大家普遍認(rèn)為所謂理想的疫苗必須具備安全、穩(wěn)定、低價(jià)，并且含有兩種或者兩種以上的保護(hù)性免疫原，而且口服一次既能產(chǎn)生良好的效果的疫苗。目前，研制的免疫疫苗中仍然沒(méi)有一種疫苗能夠完全符合以上全部條件，所以基因疫苗越來(lái)越被人們所關(guān)注?；蛞呙绫葌鹘y(tǒng)疫苗具有較多的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在：一是草魚接種基因疫苗以后，抗原蛋白在草魚細(xì)胞內(nèi)加工處理與病原的自然感染過(guò)程相似，而且他們的抗原呈遞過(guò)程也比較相似，所以能夠在草魚體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫功能；二是免疫疫苗的抗原基因能夠在草魚體內(nèi)存活較長(zhǎng)的時(shí)間，抗原蛋白能夠持續(xù)提供給免疫系統(tǒng)刺激，刺激草魚機(jī)體產(chǎn)生持久性的免疫應(yīng)答；三是基因工程疫苗能夠?qū)⑼乖虻馁|(zhì)粒混合，以便達(dá)到聯(lián)合免疫作用，提高免疫效果；四是這種免疫疫苗沒(méi)有免疫原性，能夠反復(fù)利用，成本比較低。

總之，基因疫苗比其他形式的免疫疫苗具有較強(qiáng)的抗原性，保質(zhì)期比較長(zhǎng)，制作工藝簡(jiǎn)單，運(yùn)輸方便，成本廉價(jià)，是一種全新的草魚病毒免疫方式，受到越來(lái)越多國(guó)家和地區(qū)漁民的青睞。但是基因工程疫苗中抗原基因的選擇對(duì)疫苗的免疫效果有重要的影響。

5.3.1 重組亞單位疫苗

這種疫苗技術(shù)主要是利用重組DNA技術(shù)將抗原基因進(jìn)行體外表達(dá)，使病原機(jī)體產(chǎn)生病源蛋白，利用病源蛋白的免疫保護(hù)性功能達(dá)到免疫應(yīng)答作用。其優(yōu)點(diǎn)是副作用少，不易致癌及回復(fù)突變，疫苗是通過(guò)直接合成。但是其制備過(guò)程復(fù)雜，成本較高，技術(shù)要求也高。方勤等對(duì)重組亞單位疫苗進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示，重組病毒不僅能夠也構(gòu)建表達(dá)VP6的重組病毒，而且能夠獲得一定的蛋白表達(dá)。這項(xiàng)研究為基因工程疫苗的研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。endprint

5.3.2 DNA疫苗

DNA疫苗是將魚體內(nèi)部注射一定量的某種蛋白質(zhì)抗原重組真核表達(dá)載體，以便使草魚體內(nèi)形成活體免疫系統(tǒng)，起到誘導(dǎo)免疫細(xì)胞應(yīng)答的作用。這種疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有一定的穩(wěn)定性高、安全性高、免疫全面、生產(chǎn)規(guī)模大等特點(diǎn)，被人們稱為繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的新一代疫苗。徐詩(shī)英等將草魚呼腸孤病毒（GCRV）外衣殼蛋白VP7雙基因（約0.9 kb）及團(tuán)頭魴的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子（約0.56 kp）的研究。研究結(jié)果顯示接種適當(dāng)劑量的該疫苗能起到100%的免疫保護(hù)效果。為基因工程疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

6 我國(guó)商品化疫苗研究

對(duì)于我國(guó)草魚出血病商品化疫苗的研究，前幾年，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院研發(fā)的草魚出血病活疫苗（GCHV-892 株）獲得新獸藥證書，標(biāo)志著草魚出血病活疫苗國(guó)內(nèi)外首個(gè)研制成功，自此草魚出血病活疫苗研究與應(yīng)用得到了進(jìn)一步發(fā)展。早在20世紀(jì)60年代我國(guó)就研制出了水產(chǎn)疫苗草魚出血病組織漿滅活疫苗-土法疫苗后。20世紀(jì)90年代我國(guó)研制出免疫效果好、保護(hù)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)的高效弱毒疫苗，該疫苗的研制是通過(guò)天然活性物質(zhì)對(duì)草魚病毒進(jìn)行降毒、減毒處理。該疫苗具有較多的優(yōu)點(diǎn)，如便于儲(chǔ)存、使用方便等，此疫苗應(yīng)用一次就能起到較好的免疫功能，此疫苗經(jīng)過(guò)在兩廣、江浙等地區(qū)應(yīng)用試驗(yàn)，能夠達(dá)到90%的免疫保護(hù)率。

7 草魚出血病防治研究展望

草魚出血病是一種更嚴(yán)重的病毒性魚病，對(duì)草魚的危害性比較大，發(fā)病率和死亡率在80%以上，這種病在水溫20～30 ℃時(shí)最為流行，尤其是在水質(zhì)條件差，水中各種氮和有機(jī)抗氧量偏高的情況下最易流行。病毒一旦流行開(kāi)開(kāi)很難遏制，一般健康草魚染病后7～15 d就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀以及死亡，而且此病毒具有較高的傳染性。目前，藥物治療沒(méi)有較好的治療效果。我國(guó)對(duì)草魚出血病的治療研究主要集中在免疫疫苗治療方面，并取得了教好的治療效果。

首先，草魚出血病的病原主要存在魚體活組織細(xì)胞內(nèi)而形成的大量治病病毒，對(duì)于病毒的治療如果采用化學(xué)藥物療法，藥物很難侵入被病毒感染的組織細(xì)胞內(nèi)部，即便能夠侵入病毒組織細(xì)胞含量也不高，很難對(duì)病毒產(chǎn)生具有威脅力的殺傷性，療效不高。其他藥物也很到起到較好的防病毒藥物，目前，對(duì)草魚出血病只能采取一些預(yù)防性措施，或者通過(guò)免疫系統(tǒng)增加草魚計(jì)提的免疫功能來(lái)達(dá)到防止病毒入侵的效果；再或者是改變草魚的生長(zhǎng)環(huán)境，人為制造不利于病毒繁殖的環(huán)境。其中，采用免疫法提高草魚機(jī)體的抗免疫能力，一次達(dá)到預(yù)防病毒入侵的效果，這是目前治療和預(yù)防草魚出血病的主要方式。免疫疫苗能夠較好的預(yù)防草魚出血病的發(fā)生，在防治草魚出血病病毒繁殖與復(fù)制方面具有較好的效果。

另外，還有一種預(yù)防草魚出血病發(fā)生的有效方式——干擾素，干擾素是一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，它具有較好的抗病毒、抗腫瘤功能，而且具有免疫調(diào)節(jié)功能，用于草魚出血病的防治具有較好的治療效果。邵健忠等對(duì)曾經(jīng)專門對(duì)某種干擾素進(jìn)行分析，研究結(jié)果顯示此干擾素能夠激活草魚機(jī)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，提高草魚巨噬細(xì)胞的吞噬以及抗病毒能力。錢凱先等研究結(jié)果顯示，人工誘導(dǎo)干擾素對(duì)草魚出血病的防治具有較好的效果。

近代以來(lái)，不管是我國(guó)還是世界上其他國(guó)家對(duì)草魚出血病毒的研究都從未間斷，從目前的研究結(jié)果來(lái)看，免疫預(yù)防對(duì)防治草魚病比其他治療形式具有較好的治療效果。這主要是因?yàn)槊庖咴鰪?qiáng)劑能夠提高草魚機(jī)體免疫功能，提高草魚抗病毒和抗感染能力。而且免疫疫苗在作用時(shí)免疫增強(qiáng)所需要的時(shí)間比較短，持續(xù)的效果比較長(zhǎng)，是目前提高魚體免疫活性，增強(qiáng)草魚抵抗力最為有效的方法，在草魚出血病的預(yù)防與治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：趙中正）endprint