張孝清++曹國弟++孫子龍

摘要：為了探測精子中蛋白激酶A（PKA）的定位表達，通過飼養(yǎng)8只性成熟昆明雄性小鼠，49天后采集其精子制備精子懸液，涂片。用PKA多克隆抗體與精子進行免疫試驗，陰性對照組用PBS取代，然后用FITC標記的羊抗兔二抗進行熒光標記。用熒光顯微鏡鏡檢，結(jié)果顯示精子中PKA蛋白的表達部位主要為精子尾部的主段和中段。

關(guān)鍵詞：免疫熒光技術(shù)；小鼠；精子；PKA

中圖分類號：Q492.4 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）12-0005-02

作為畜牧業(yè)大國的中國，家畜的繁殖直接影響到畜牧業(yè)的順利和健康發(fā)展。而在家畜繁殖中，精子的質(zhì)量又是影響家畜繁殖的直接因素，精子蛋白質(zhì)質(zhì)量或數(shù)量的變化往往是精子的結(jié)構(gòu)或功能異常的表現(xiàn)，因此，對家畜精子的蛋白質(zhì)組成及變化的全面了解將有助于探討精子發(fā)生、分化及精卵相互識別與結(jié)合的生理病理機制。

蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）作為精子中的一種蛋白激酶，可以通過磷酸化激活多種酶，直接影響精子蛋白的功能，在精子的成熟、運動和受精過程中發(fā)揮著重要作用[1]。因此，通過對精子中PKA的研究，有望從蛋白質(zhì)整體水平了解精子的發(fā)生及受精機制。

目前蛋白質(zhì)的檢測分為定量檢測和定位檢測。蛋白質(zhì)的定位檢測有免疫熒光技術(shù)和免疫組織化學技術(shù)。熒光抗體技術(shù)又稱免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique），是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，IFA始創(chuàng)于20世紀40年代初，由Coons等（1941年）首次采用熒光素標記抗體檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原并獲得成功?，F(xiàn)已廣泛應用于多種疾病的診斷與檢測。本試驗用免疫熒光技術(shù)對小鼠精子PKA蛋白的定位表達，為以后進一步研究精子PKA蛋白的功能提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

多聚甲醛（AR）、PKA多克隆抗體、BSA、TritonX-100、FITC標記的羊抗兔二抗；生物顯微鏡、圖像分析軟件（Image-Proplus v.5.1）、HPS-250生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物 8只性成熟昆明雄性小鼠，體重20 g左右，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，均為普通級動物。供試小鼠分籠飼養(yǎng)，飲用去離子水，并飼喂標準飼料，整個試驗期間所有小鼠均自由采食和自由飲水的飼養(yǎng)方式。49 d后[（40±2） d為一個精子發(fā)生周期]，取出小鼠附睪尾部及輸精管，用針頭沖出精子，放入1.5 mL EP管中，在二氧化碳培養(yǎng)箱孵育10 min，獲取純凈的精子懸液，涂片，進行免疫熒光試驗。

1.2.2 免疫熒光組織化學試驗 37 ℃用PBS洗精；添加含4%多聚甲醛的PBS固定（37 ℃，30 min）；用含0.05 mol/L氨基乙酸的PBS洗3次；100 μL精子懸液涂片；用0.2%TritonX-100的PBS浸10 min，后3×3次/minPBS沖洗；3%BSA的PBS封閉（37 ℃，1 h）；用1：100的一抗4 ℃孵育過夜，之后37℃ 2 h（陰性對照不加一抗，用PBS取代）；用4 ℃的PBS清洗3次，每次5 min，吹干；1：200的二抗（FITC標記的羊抗兔二抗溶于1%BSA-PBS）37 ℃ 1 h；PBS洗3次，3～5 min/次，多余的濾液吹干；封片（緩沖甘油封片劑）；最后用熒光顯微鏡鏡檢。

2 結(jié)果與分析

陰性對照組在普通光學顯微鏡明場下結(jié)果見圖1，熒光顯微鏡下結(jié)果見圖2；試驗組在普通光學顯微鏡明場下結(jié)果見圖3，熒光顯微鏡下如圖4。圖5為圖3和圖4的合成圖。

結(jié)果顯示精子中PKA蛋白的表達部位為精子尾部的主段和中段。

3 討論

3.1 PKA蛋白的生物功能及在精子中的作用

PKA全酶包括4個亞基 （R2C2），兩個相同的調(diào)節(jié)亞基（R）和兩個相同的催化亞基（C），R亞基有兩個cAMP結(jié)合位點，具有調(diào)節(jié)功能。在細胞內(nèi)cAMP是重要的第二信使物質(zhì)，在細胞的跨膜信息轉(zhuǎn)導中起著信號放大和調(diào)節(jié)細胞功能的重要作用。PKA是第二信使的直接靶酶，通過磷酸化或去磷酸化作用[2]，控制信號轉(zhuǎn)導途徑中其他酶類或蛋白質(zhì)的活性，介導cAMP的信號轉(zhuǎn)導，PKA為依賴cAMP的蛋白激酶，主要作用是傳遞細胞激外刺激信號、影響膜蛋白的磷酸化而改變細胞膜的通透性，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等，它們均是通過使各自的底物磷酸化來調(diào)節(jié)細胞的代謝、生長和增殖。

cAMP/PKA 信號通路：cAMP/PKA 這條信號通路通常被認為是調(diào)節(jié)哺乳動物精子運動的一條極為重要的途徑[3]。在哺乳動物精子獲能過程中，這條信號通路還被認為是胞內(nèi)信號傳遞的主要通路。胞外刺激信號與精子表面受體結(jié)合后，通過GTP結(jié)合蛋白（G蛋白）傳遞給腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC）使其活化。維持精子活力重要的過程是激活PKA后催化精子鞭毛蛋白磷酸化。通過cAMP/PKA 和鈣離子信號通路的共同作用，可使精子胞體內(nèi)cAMP 水平迅速上升，從而上調(diào)精子鞭毛發(fā)生劇烈的波動，導致精子超激活運動[4]。

3.2 精子中PKA蛋白的表達

PKA蛋白的表達在精子各部都有，可以推測PKA蛋白參與精子大多數(shù)生理活動（如精子的成熟、運動和頂體反應等），說明PKA蛋白在精子活動中起著非常重要的作用，影響著精子的活力。

4 小結(jié)

免疫熒光技術(shù)以其高特異性、高靈敏度等優(yōu)點用于蛋白質(zhì)的檢測。本試驗用熒光顯微鏡鏡檢，結(jié)果顯示精子中PKA蛋白的表達部位主要為精子尾部的主段和中段。

參考文獻：

[1] 李 揚.蛋白激酶A對精子頂體反應和活力的影響[J].中國男科學雜志，2002（1）：63-65.

[2] 周思暢，等.獲能期間精子蛋白的酪氨酸磷酸化[J].生命科學，2006，18（3）：285-289.

[3] 李 揚.環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信號傳導通路對精子運動功能調(diào)節(jié)機制的研究[D].武漢：華中科技大學，2005.

[4] 李 楊，劉繼紅.雙丁酰環(huán)磷酸腺苷對人精子運動功能的影響[J] .中華男科學，2002，8（6）：398-400.