徐為中，王 芳，胡 波，范志宇，魏后軍，宋艷華，薛家賓，仇汝龍，劉 星

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014)

多殺性巴氏桿菌是世界各地引起巨大經(jīng)濟(jì)損失的病原體。多殺性巴氏桿菌可以引起牛羊的支氣管肺炎，黃牛和水牛的出血性敗血癥，豬的萎縮性鼻炎，家兔的傳染性鼻炎和禽霍亂。人感染多殺性巴氏桿菌主要由于狗貓抓咬后細(xì)菌通過傷口感染導(dǎo)致蜂窩織炎和淋巴管炎，有時(shí)形成復(fù)雜膿腫和化膿性關(guān)節(jié)炎，在免疫功能低下時(shí)多殺性巴氏桿菌甚至可以引起全身系統(tǒng)性感染如腦膜炎和心內(nèi)膜炎［1］。

外膜蛋白僅存在革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜中，是組成細(xì)胞膜的主要成分，在維持細(xì)胞形態(tài)和物質(zhì)運(yùn)輸過程中起著重要作用，多殺性巴氏桿菌外膜蛋白被認(rèn)為是重要的免疫原，對(duì)多殺性巴氏桿菌病的發(fā)病機(jī)理和免疫保護(hù)有重要作用［2］。ompA是多殺性巴氏桿菌主要外膜蛋白之一，ompA在多殺性巴氏桿菌感染過程中對(duì)宿主細(xì)胞的粘附、侵襲，血清抗體的產(chǎn)生，免疫逃避和免疫靶向起重要作用［3-4］。多殺性巴氏桿菌ompA是暴露在細(xì)胞膜表面，能在體內(nèi)表達(dá)，具有良好免疫原性和抗原性的保守蛋白［5］。牛免疫接種多殺性巴氏桿菌外膜蛋白，能產(chǎn)生高的抗體水平，能抵抗攻毒試驗(yàn)，其中ompA是牛產(chǎn)生抗體的主要蛋白［6］。筆者擴(kuò)增出兔源多殺性巴氏桿菌C51-17ompA基因，在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，免疫印跡試驗(yàn)顯示，重組蛋白具有較好的免疫原性，以期為以后兔多殺性巴氏桿菌的診斷和疫苗的研制提供優(yōu)質(zhì)的蛋白抗原。

1 材料與方法

1．1 菌株和質(zhì)粒 兔源多殺性巴氏桿苗C51-17菌株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所鑒定保存;質(zhì)粒pGEX-6p-1、大腸桿菌BL21、大腸桿菌DH5α購自大連寶生物(TaKaRa)有限公司。

1．2 試劑 DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、dNTPs、高保真Pfx DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶和DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)有限公司，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自生興生物有限公司;DAB顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，NC膜、IPTG購自基天生物有限公司。

1．3 omp A基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的多殺性巴氏桿菌ompA序列AE004439，應(yīng)用PrimerPremier軟件設(shè)計(jì)2對(duì)擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌C51-17ompA基因的引物:PmAF:5′-TACCTTTAACAGCG-3′(Xho I)。引物由上海英濰捷基生物有限公司合成，引物PmAF、PmAR擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌ompA全基因;引物PmADF、PmADR分別加入酶切位點(diǎn)Bam H I、Xho I擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌ompA去信號(hào)肽基因。

1．4 多殺性巴氏桿基因組DNA的提取 將多殺性巴氏桿菌C51-17接種于馬丁肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，所得的菌液用于提取模板DNA，DNA的提取按照柱式細(xì)菌DNAout試劑盒說明書進(jìn)行。

1．5 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:模板DNA 4．0 ul，Pfx DNA聚合酶0．4 ul，10 × Taq Buffer 2．5 ul，上游、下游引物(20 umol/L)各 1．0 ul，dNTPs(2．5 mmol/L)2．0 ul，MgCl2(25 mmol/L)2．5 ul，H2O 11．6 ul。

PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性35 s，54℃退火30 s，68℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán);68℃延伸10 min，產(chǎn)物4℃保存。

PCR產(chǎn)物凝膠電泳鑒定:PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的片段后送至上海英濰捷基公司測(cè)序。

1．6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用Bam H I、Xho I雙酶切pGEX-6p-1質(zhì)粒，膠回收試劑盒回收酶切后的載體，同時(shí)用Bam H I、Xho I雙酶切去信號(hào)肽ompA基因擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收試劑盒回收含去信號(hào)肽ompA基因片段，用T4連接酶連接雙酶切后的pGEX-6p-1質(zhì)粒和去信號(hào)ompA基因片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，用Bam H I、Xho I雙酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒pGEX-dompA送至上海英濰捷基公司測(cè)序。

1．7 大腸桿菌BL21表達(dá)ompA基因及蛋白SDS-PAGE分析 將重組質(zhì)粒pGEX-dompA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21細(xì)菌，挑取單個(gè)菌落，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度為0．2 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，同時(shí)設(shè)含空白載體(pGEX-6p-1)大腸桿菌對(duì)照。表達(dá)產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1．8 Western blot分析 誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)移后的NC膜在5%的脫脂乳中4℃封閉過夜，先用PBST洗滌2次后，PBS再洗滌1次，每次10 min;洗完后加入1∶200倍稀釋的兔抗Pm陽性血清37℃孵育1 h后，棄去一抗，先用PBST洗滌2次，PBS再洗滌1次，再以HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，37℃孵育1 h，棄去二抗，先用PBST洗滌2次，PBS再洗滌1次，DAB顯色15 min，用水洗滌反應(yīng)終止。

2 結(jié)果與分析

2．1 ompA基因的擴(kuò)增和克隆 利用引物PmAF、PmAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增了ompA基因。擴(kuò)增片段大小為1 062 bp;引物PmADF，PmADR擴(kuò)增ompA去信號(hào)肽基因，擴(kuò)增片段大小為999 bp，編碼332個(gè)氨基酸(圖1)。測(cè)序結(jié)果正確。

2．2 重組載體pGEX-dompA雙酶切鑒定 將引物PmADF、PmADR擴(kuò)增的ompA去信號(hào)肽基因插入到pGEX-6p-1載體，構(gòu)建成功的重組載體pGEX-dompA，用Bam H I，Xho I雙酶切重組載體pGEX-dompA，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離得到去信號(hào)肽ompA基因999 bp、pGEX-6p-1載體4 900 bp，鑒定結(jié)果見圖2，將酶切鑒定符合的重組載體pGEX-dompA送上海英濰捷基公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與PmADF、PmADR擴(kuò)增ompA去信號(hào)肽基因完全一致。

2．3 大腸桿菌導(dǎo)入BL21誘導(dǎo)表達(dá)ompA蛋白SDS-PAGE和Western blot分析 將重組載體pGEX-dompA導(dǎo)入BL21大腸桿菌后，挑取單菌落接種至AMPrLB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度為0．2 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果出現(xiàn)63 ku的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。Western blot分析結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白與兔抗多殺性巴氏桿菌陽性血清在63 ku處出現(xiàn)免疫反應(yīng)，而與兔抗多殺性巴氏桿菌陰性血清沒有反應(yīng)(圖3)。

3 結(jié)論與討論

該研究對(duì)兔源多殺性巴氏桿菌C51-17外膜蛋白o(hù)mpA基因進(jìn)行了擴(kuò)增，開放閱讀框包含1 062 bp堿基，翻譯成蛋白包含353個(gè)氨基酸，分子量38 ku，用Signal PV2．0預(yù)測(cè)信號(hào)肽的裂解位點(diǎn)位于第21～22個(gè)氨基酸之間，在NCBI中Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示，與Pm70菌株核苷酸的同源性達(dá)96%，氨基酸的同源性達(dá)98%。在構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-dompA時(shí)去掉前面63個(gè)編碼信號(hào)肽核苷酸，避免大腸桿菌表達(dá)多殺性巴氏桿菌ompA時(shí)，重組蛋白融合到宿主菌的細(xì)胞膜中，干擾宿主細(xì)菌細(xì)胞膜的功能，影響重組蛋白的表達(dá)，去掉信號(hào)肽的重組多殺性巴氏桿菌外膜蛋白o(hù)mpA得到高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)證明具有較好的免疫原性。

ompA蛋白具有較好的抗原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，重組的多殺性巴氏桿菌外膜蛋白o(hù)mpA免疫小鼠后，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th2型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高IgG1抗體［7］，表明體外表達(dá)的重組蛋白免疫動(dòng)物同樣刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此該研究表達(dá)的重組多殺性巴氏桿菌蛋白o(hù)mpA可以作為診斷試劑盒和疫苗開發(fā)的蛋白使用。

［1］EWERSC，LUBKE-BECKER A，BETHE A，et al．Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated fromdifferent hosts with various disease status［J］．Vet Microbiol，2006，114:304-317

［2］BASAGOUDANAVAR SH，SINGH D K，VARSHNEY B C，et al．Immunization with outer membrane proteins of Pasteurella multocida(6:B)provides protection in mice［J］．JVet Med A Physiol Pathol Clin Med，2006，53(10):524-530．

［3］DABOSM，CONFERA W，QUIJANO-BLASRA，et al．Molecular and immunological characterization of Pasteurella multocida serotype A:3 OmpA:evidence of its role in P．multocida interaction with extracellular matrix molecules［J］．Microb Pathog，2003，35(4):147-157．

［4］SMITH SG，MAHON V，LAMBERT M A，et al．A molecular Swiss army knife:OmpA structure，function and expression［J］．FEMS Microbiol Lett，2007，273(1):1-11．

［5］CARPENTER T，KHALID S，SANSOM M S，et al．A multidomain outer membrane protein from Pasteurella multocida:Modelling and simulation studies of PmOmpA［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1768(11):2831-2840．

［6］PRADOM E，DABO SM，CONFER A W，et al．Immunogenicity of ironregulated outer membrane proteins of Pasteurella multocida A:3 in cattle:Molecular characterization of the immunodominant heme acquisition system receptor(HasR)protein［J］．Vet Microbiol，2005，105(3/4):269-280．

［7］DABOSM，CONFER A，MONTELONGO M，et al．Vaccination with Pasteurella multocida recombinant OmpA induces strong but non-protective and deleterious Th2-type immune response in mice［J］．Vaccine，2008，26:4345-4351．