組織中RNA提取過程中影響因素的研究①

白 雪, 張麗穎, 劉莉娜, 李懷荊, 王艷秋, 紀(jì)漢庭, 孫艷男, 關(guān)寶生

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007；2.綏化市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 綏化 152000)

組織中RNA提取過程中影響因素的研究①

白 雪1, 張麗穎1, 劉莉娜2, 李懷荊1, 王艷秋1, 紀(jì)漢庭1, 孫艷男1, 關(guān)寶生1

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007；2.綏化市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 綏化 152000)

在分子生物學(xué)的研究和應(yīng)用中，組織RNA提取技術(shù)已經(jīng)成為基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從組織中提取高質(zhì)量的RNA是構(gòu)建cDNA文庫、研究基因表達(dá)和調(diào)控等的基礎(chǔ)；在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，RNA樣品易受核糖核酸酶(RNase)的污染，該酶可以降解RNA；在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制各個(gè)影響因素，防止RNase的污染；筆者在閱讀大量相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，就組織中RNA提取過程中的影響因素總結(jié)如下。

RNA提取; 實(shí)驗(yàn)操作; 影響因素;RNase

RNA的提取技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)中最常用的操作技術(shù)之一。不同組織中總RNA的提取實(shí)質(zhì)上就是將組織細(xì)胞裂解，從而釋放RNA，在進(jìn)一步的研究中，我們高度依賴所提取的總RNA的質(zhì)量[1]。RNA樣品易受環(huán)境因素特別是RNase的影響而降解[2]，提取RNA的過程中，只要存在少量的RNase就會(huì)引起RNA降解。故在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制各個(gè)影響因素、防止RNase的污染，是提取高質(zhì)量RNA樣品的關(guān)鍵。

1 組織質(zhì)量的影響

組織樣本質(zhì)量是RNA提取實(shí)驗(yàn)成功與否的重要因素之一。我們的實(shí)驗(yàn)是小鼠腫瘤組織總RNA的提取，基本所有組織和細(xì)胞都含有內(nèi)源性RNase，為了防止總RNA的降解，使用液氮來速凍組織，在研磨組織的過程中，我們使用研缽加液氮研磨法進(jìn)行研磨[3]。即研磨過程中將組織放入研缽后，加入液氮研磨并及時(shí)添加液氮，確保腫瘤組織能夠一直浸在液氮中，防止RNA降解，保證RNA的質(zhì)量。

2 實(shí)驗(yàn)器具的影響

由于RNA本身不穩(wěn)定，加之RNase的普遍存在，使得分離完整的RNA分子更為困難[4]。在RNA提取過程中最主要是防止外源性RNase的污染，首先是要保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺中完成；其次是對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行處理，主要有以下幾點(diǎn)：(1)研磨過程使用的研缽需要高溫干燥處理后使用；(2)實(shí)驗(yàn)中使用的EP管，槍頭等塑料制品，需要用DEPC水[1]浸泡24h后，經(jīng)高溫滅菌干燥后使用；(3)為了防止RNase的污染，用DEPC水替代三蒸水進(jìn)行溶液的配制；(4)RNA操作中使用專用的器械，有條件的也可以設(shè)置專用實(shí)驗(yàn)室。

3 實(shí)驗(yàn)人員的影響

實(shí)驗(yàn)人員對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的影響，主要是外源性RNase的影響。外源性的RNase是無處不在的，它很容易污染實(shí)驗(yàn)中的各種器材、實(shí)驗(yàn)用品和實(shí)驗(yàn)試劑等；實(shí)際操作過程中，手套是最容易污染樣品的，因此手套要勤換；實(shí)驗(yàn)操作人員說話過程中所帶的唾液中也會(huì)攜帶RNase，會(huì)導(dǎo)致樣品的降解，故需帶口罩操作；在RNA整個(gè)提取過程中，實(shí)驗(yàn)人員熟練快速的完成整個(gè)RNA的提取，減少實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間，也可有效減少外源性RNase污染的幾率。

4 實(shí)驗(yàn)試劑的影響

RNA提取的過程中，每一步所用試劑的量，以及所用的時(shí)間都會(huì)影響RNA的完整性、含量及純度。

4.1 Trizol試劑

Trizol試劑是即用型細(xì)胞和組織總RNA提取試劑，可直接從組織或細(xì)胞中提取總RNA，能迅速裂解細(xì)胞，并抑制細(xì)胞釋放出來的核酸酶；使用Trizol試劑時(shí)，1mLTrizol最多裂解100mg的組織，而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)100mg的組織使用1.2mLTrizol裂解，可以獲得更滿意的結(jié)果。

4.2 氯仿

氯仿也叫三氯甲烷，是一種有機(jī)物-烴的衍生物，在光照下遇空氣會(huì)逐漸被氧化并生成劇毒的光氣，因此需要存放在密封的棕色瓶中；氯仿分離是RNA提取實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟之一，勻漿后的組織液中加入氯仿，震蕩離心后，RNA會(huì)溶解在上層的水相中，轉(zhuǎn)移RNA到新管的過程中，采用小槍頭少量多次吸取，可防止誤吸下層雜質(zhì)[6]。

4.3 異丙醇和乙醇

RNA和某些雜質(zhì)不溶于異丙醇，故異丙醇具有沉淀RNA的作用，RNA沉于管底后，用75%的乙醇對沉淀進(jìn)行清洗，乙醇可洗去沉淀中可能的有機(jī)物雜質(zhì)和殘留的異丙醇。但由于醇類可以抑制核酸的反應(yīng)，因此在棄乙醇后晾干的步驟是至關(guān)重要的，在這里不可以用加熱或離心的方式使RNA干燥，否則會(huì)出現(xiàn)RNA樣品很難溶解的現(xiàn)象。

5 RNA濃度的測定

在RNA提取之后，我們使用DU800紫外分光光度計(jì)測OD值來定量RNA的濃度。在測定OD值時(shí)，每一個(gè)樣品測定前都需要用DEPC水進(jìn)行儀器校正，測定后用蒸餾水徹底清洗比色杯，從而避免樣品之間交叉污染，影響結(jié)果。

6 RNA的保存

由于RNase廣泛存在，提取后的總RNA中常常會(huì)存在少量的RNase，隨著保存時(shí)間的延長，極易出現(xiàn)RNA降解的情況；實(shí)驗(yàn)中一旦出現(xiàn)大量的RNA降解，會(huì)直接導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法順利進(jìn)行。cDNA可反映RNA的性狀，而且cDNA的穩(wěn)定性較好。因此，提取后的RNA經(jīng)過檢測純度和濃度合格后，應(yīng)盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或取部分RNA提取物及時(shí)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA保存，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

7 結(jié)語

RNA質(zhì)量的好壞會(huì)直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，提取高質(zhì)量RNA是后期實(shí)驗(yàn)的前提和基礎(chǔ)。因此，熟練的掌握RNA提取的基本原理、注意事項(xiàng)和各種影響因素，對實(shí)驗(yàn)的成功與否至關(guān)重要。以上是筆者總結(jié)的一些經(jīng)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中遇到具體的問題，還需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行不斷的改進(jìn)和完善，從而使實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌瓿伞?/p>

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[3]張宏山, 許明, 張陽, 等. 小鼠心肌組織3種總RNA提取方法比較[J]. 臨床心血管病雜志, 2010, (2):149-150

[4](美)R.E.法雷爾.RNA分離與鑒定實(shí)驗(yàn)指南:RNA研究方法(原著第3版). 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008, 26-27

[5]王長曄.RNA提取過程中DEPC的毒性[J]. 創(chuàng)新技術(shù), 2008, (5):5-6

[6]戴先成, 柴智鋒, 徐永城, 等.Trizol法大鼠心肌總RNA提取方法探討[J]. 刑事技術(shù), 2014,(3): 15-16

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號：H201488；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號：201410222053；佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)項(xiàng)目，編號：sq2012-37；佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號：XSYZ2014-004。

白雪(1982～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。

關(guān)寶生(1980～)男，黑龍江佳木斯人，在讀博士研究生，助理研究員。E-mail：gbs@jmsu.edu.cn。

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