黃凌云　秦愛(ài)平　楊敏　劉江華　全宏梅　廖斌

【摘要】目的 研究體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUECV304）在間斷性高濃度胰島素與持續(xù)性高濃度胰島素作用下誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白的不同表達(dá)，從而進(jìn)一步研究間斷性高濃度胰島素血癥導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的原因及發(fā)病機(jī)制。方法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUECV304）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究間斷性高濃度胰島素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響。分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即間斷性高濃度胰島素波動(dòng)組（含100 nmol/L胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)液及含1 nmol/L胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)液輪換，每隔8小時(shí)更換一次）、持續(xù)性高濃度胰島素組（含100 nmol/L胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)液）、含正常濃度胰島素組（含1 nmol/L胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)液）、陰性對(duì)照組（不含胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)液）；再依次更換新鮮條件細(xì)胞培養(yǎng)液（每次培育8小時(shí)后），四組細(xì)胞均培育72小時(shí)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果四組內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)含不同濃度胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時(shí)后，結(jié)果表明：正常濃度胰島素組、間斷性高濃度胰島素組、持續(xù)性高濃度胰島素組的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平均不同程度地增高，分別為對(duì)照組的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）、3.31倍（P<0.001），其中以間斷性高濃度胰島素組增高幅度尤為明顯，高于持續(xù)性高濃度胰島素組（P<0.001）。結(jié)論相對(duì)于持續(xù)性高濃度胰島素，間斷性高濃度胰島素更能增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)，提示間斷性高濃度胰島素可能通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)途徑而損傷血管內(nèi)皮的功能，從而促進(jìn)糖尿病血管并發(fā)癥的進(jìn)一步發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 間斷性高濃度胰島素；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；蛋白表達(dá)

中圖分類號(hào)：R587.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.01.003

高胰島素血癥是國(guó)內(nèi)外糖尿病及高血壓患者因心血管疾病死亡的重要原因[1，2] 。目前認(rèn)為糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性與高血糖、高胰島素血癥、異常脂血癥等眾多病理因素有關(guān)。有臨床研究表明在肥胖和超重兒童中有高胰島素血癥者占總?cè)藬?shù)的44.7%[3]。因?yàn)橐葝u素抵抗而產(chǎn)生隨之而來(lái)的高胰島素血癥存在于許多疾病中，是糖尿病早期的癥狀之一[4]。而且基礎(chǔ)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，使孕期懷孕大鼠血壓升高的主要原因?yàn)楦咭葝u素血癥[5]。但高胰島素血癥如何導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的病理機(jī)制至今尚未完全闡明。目前許多學(xué)者認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是眾多血管性疾病發(fā)生的始動(dòng)步驟。因此，深入開展高胰島素血癥致內(nèi)皮功能損傷機(jī)理的研究將有利于進(jìn)一步闡明糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。有研究表明：通過(guò)免疫炎癥反應(yīng)高濃度胰島素參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[6]。鑒于內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（NO）分泌的異常變化是內(nèi)皮細(xì)胞受損的最早期表現(xiàn)并且加入炎癥反應(yīng)，且誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）與炎癥反應(yīng)相關(guān)?？紤]糖尿?。?型）是一種慢性炎癥性疾病，很多炎癥因子加入2型糖尿病的發(fā)生及其并發(fā)癥的發(fā)展[7，8]。所以我們研究含不同高濃度胰島素形成的間斷性高濃度胰島素培養(yǎng)液培養(yǎng)下的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白水平表達(dá)，與含持續(xù)性高濃度胰島素細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)下的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白水平表達(dá)有何不同的影響，旨在進(jìn)一步探索間斷性高胰島素血癥促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的病理生理機(jī)制，進(jìn)而為糖尿病血管并發(fā)癥的防治及胰島素的合理應(yīng)用開辟新的途徑。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑 自通化東寶藥業(yè)股份有限公司購(gòu)重組人胰島素（甘舒霖R）；自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞典藏中心購(gòu)內(nèi)皮細(xì)胞株（HUECV304）細(xì)胞；自杭州四季青公司購(gòu)胎牛血清（FBS）和新生牛血清；自Gibco公司購(gòu)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（低糖型）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及鑒定先將HUECV304放入含5%二氧化碳的37℃（持續(xù)恒溫）細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。等待細(xì)胞長(zhǎng)成亞融合狀態(tài)時(shí)，再用1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞3～5 min，待細(xì)胞消化至皺縮、彼此分離抑或呈大片狀分離形態(tài)時(shí)即吸去消化液，再滴入適當(dāng)量的含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液用來(lái)終止細(xì)胞消化。然后，將大片狀分離細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，待計(jì)數(shù)后用無(wú)菌吸管按1×105/ml等量吸取細(xì)胞至新的細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，將細(xì)胞靜止培養(yǎng)4～6小時(shí)，待細(xì)胞固定后再更換培養(yǎng)液，用倒置相差顯微鏡觀察新生代細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。用Ⅷ因子抗原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)（+）方法鑒定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞株，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后，取生長(zhǎng)狀態(tài)好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期內(nèi)皮細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞接近融合時(shí)，為了使細(xì)胞同步，四組均換上不含血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培育一天，再換用低糖型DMEM條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組如下：①間斷性高濃度胰島素組（含1 nmol/L胰島素及100 nmol/L胰島素兩種條件培養(yǎng)液，每間隔8小時(shí)更換1次條件培養(yǎng)液，簡(jiǎn)稱間斷性高濃度胰島素組）；②持續(xù)性高濃度胰島素組（含100 nmol/L胰島素）；③正常濃度胰島素組（含1 nmol/L胰島素）；④陰性對(duì)照組（不含胰島素），按照時(shí)間更換一次新鮮條件培養(yǎng)液（每間隔8小時(shí)），共培育細(xì)胞72小時(shí)后行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3應(yīng)用SP試劑盒免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)iNOS基因蛋白表達(dá)水平 （1）先將傳代細(xì)胞加入已放入蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%融合時(shí)，再加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)。（2）吸出條件培養(yǎng)液后先用PBS沖洗5次，再使用95%酒精固定30 min。（3）水化：先用無(wú)水乙醇作用3次，每次5 min；再用95%乙醇作用3次，每次5 min，然后用75%乙醇作用3次，每次5 min。（4）加入hydrogen peroxide 室溫阻滯10～15 min，然后用001 M平衡鹽緩沖液沖洗細(xì)胞4次，每次沖洗5 min。（5）加入U(xiǎn)Ltra Ⅴ阻斷劑，室溫阻滯5 min，再0.01 M平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次5 min。（6）加入一抗（兔抗人iNOS抗體），于4℃過(guò)夜，再用0.01 M平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次5 min。（7）加入二抗（羊抗兔）室溫孵育10 min后用0.01 M PBS緩沖液沖洗4次，每次5 min。（8）加入streptavidin peroxidase，室溫培養(yǎng)10 min，再用0.01 M平衡鹽緩沖液沖洗細(xì)胞4次，每次5 min。（9）加DAB顯色劑至細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板室溫孵育，顯微鏡下觀察，5～15 min（視染色深淺而定）后，再用001 M平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次5 min。（10）再加入1%HCl 70%酒精淡化及二甲苯透明。（11）用酒精脫水：先用75%乙醇脫水3次，每次5 min，再用95%乙醇脫水3次，每次5 min，最后用無(wú)水乙醇脫水3次，每次5 min。（12）最后晾干，用中性樹脂封片保存。endprint

1.2.4結(jié)果判定 細(xì)胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，細(xì)胞中未出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陰性染色。最后均采用Image J 1.34軟件進(jìn)行分析處理所有圖像資料。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 建立數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量數(shù)據(jù)，資料符合正態(tài)分布及方差齊性，用單向方差分析法（Oneway ANOVA）進(jìn)行組間比較，P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果待不同濃度胰島素組處理內(nèi)皮細(xì)胞72小時(shí)后，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)水平，結(jié)果提示：正常濃度組、間斷性高濃度胰島素組、持續(xù)性高濃度胰島素組的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的增加，分別為對(duì)照組的1.92倍（P<0001）、4.52倍（P<0001）及3.31倍（P<0001）。其中以間斷性高濃度胰島素組增高幅度尤為明顯，且與持續(xù)性高濃度胰島素組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0001）。各組內(nèi)皮細(xì)胞圖像見(jiàn)圖1A～D。對(duì)各組細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)圖像采用Image J 134圖像分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1各組內(nèi)皮細(xì)胞圖像（SP法：×400）。A： 陰性對(duì)照組；B：正常濃度胰島

素組；C：持續(xù)性高濃度胰島素組；D：間斷性高濃度胰島素組。

3討論高胰島素血癥是心血管疾病及糖尿病、高血壓病等多種疾病的病理生理基礎(chǔ)[9]，所以目前臨床內(nèi)分泌學(xué)已有大量研究關(guān)注高胰島素血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。許多臨床研究表明，內(nèi)源性高胰島素

表1各組iNOS蛋白表達(dá) （n=3，±s）

組別iNOS蛋白陰性對(duì)照組10.3±0.8正常濃度胰島素組 19.8±0.7a持續(xù)性高濃度胰島素組34.1±1.0ab間斷性高濃度胰島素組46.6±1.3abcF799.31P0.000注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.001；與正常濃度胰島素組比較，bP<0.001；與持續(xù)性高濃度胰島素組比較，cP<0.001。

血癥產(chǎn)生的原因?yàn)榉逝炙鶎?dǎo)致的內(nèi)源性胰島素抵抗[10]。高胰島素血癥出現(xiàn)于高血壓及冠心病患者及其一級(jí)親屬中[11]。有臨床研究顯示，2型糖尿病并肥胖患者因胰島素抵抗具有內(nèi)源性高胰島素血癥，1型糖尿病患者產(chǎn)生高胰島素血癥的原因是因?yàn)樾枰⑸湟葝u素降糖治療[12]。2型糖尿病并肥胖患者體內(nèi)空腹胰島素水平異常增高（因?yàn)榇嬖谝葝u素抵抗）；在應(yīng)用口服刺激β細(xì)胞分泌降血糖藥后又會(huì)人為地造成餐后高胰島素血癥；而1型糖尿病患者需要外源性胰島素治療，由于胰島素治療往往超過(guò)人正常胰島素分泌量才有治療效果，加上注射的胰島素不需先通過(guò)肝臟代謝而是直接進(jìn)入人體循環(huán)，使得糖尿病患者全天某時(shí)段或全天外周血管血漿胰島素水平總高于生理濃度，從而導(dǎo)致使用外源性胰島素治療的2型及1型糖尿病患者伴發(fā)的冠狀動(dòng)脈事件發(fā)生率大幅度升高[13]。提示無(wú)論是外源性還是內(nèi)源性高胰島素血癥，均可能在糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中具有十分重要的作用。然而，對(duì)高胰島素血癥是如何誘發(fā)及促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制目前尚缺乏深入了解。血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病患者發(fā)生多種心血管疾病共同的病理生理改變。因此對(duì)高胰島素血癥導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的原理及其發(fā)生機(jī)理的研究具有重要意義。近年來(lái)研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的基礎(chǔ)作用。動(dòng)物研究表明在內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的小鼠容易出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化[14]。內(nèi)皮依賴性胰島素抵抗可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活性氧增加，引起血管舒張功能障礙。同樣胰島素還可通過(guò)影響iNOS基因表達(dá)的多態(tài)性進(jìn)而影響內(nèi)皮功能[15]。臨床研究表明存在胰島素抵抗的糖尿病患者，每天由于進(jìn)食、口服刺激β細(xì)胞分泌胰島素的降糖藥及注射外源性胰島素等因素，導(dǎo)致血漿胰島素水平會(huì)出現(xiàn)空腹高胰島素狀態(tài)及餐后高胰島素狀態(tài)，并不可能長(zhǎng)期維持穩(wěn)定濃度的高胰島素狀態(tài)，血漿胰島素水平總會(huì)在一定濃度水平范圍出現(xiàn)頻繁的異常波動(dòng)形態(tài)，導(dǎo)致間斷性高濃度胰島素血癥。然而間斷性高濃度胰島素血癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)研究間斷性高濃度胰島素對(duì)iNOS蛋白表達(dá)的影響，以闡明間斷性高濃度胰島素血癥導(dǎo)致血管內(nèi)皮損害的可能機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)含不同濃度胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞72小時(shí)后，正常濃度胰島素組、間斷性高濃度胰島素組及持續(xù)性高濃度胰島素組的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的增加，分別為對(duì)照組的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）及3.31倍（P<0.001），以間斷性高濃度胰島素組上調(diào)幅度尤為明顯，顯著高于持續(xù)性高濃度胰島素組（P<0.001）。

綜上所述，本研究首次提出了間斷性高濃度胰島素血癥的概念，并對(duì)間斷性高濃度胰島素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：間斷性高濃度胰島素相對(duì)于持續(xù)性高濃度胰島素更能上調(diào)iNOS蛋白表達(dá)，表明間斷性高濃度胰島素血癥可能是一種重要的致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。因此這不僅僅為糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，而且可能為指導(dǎo)糖尿病患者的合理胰島素治療提供臨床依據(jù)。同時(shí)提示我們?cè)谂R床實(shí)踐中，不僅僅要防止形成空腹及餐后高胰島素血癥，而且要盡量避免體內(nèi)血漿胰島素處于頻繁波動(dòng)狀態(tài)，這可能對(duì)延緩糖尿病血管病變的發(fā)生及發(fā)展有著十分重要的基礎(chǔ)及臨床意義。參考文獻(xiàn)[1] Lastra G，Dhuper S，Johnson MS，et al.Salt，aldosterone，and insulin resistance：impact on the cardiovascular system[J].Nat Rev Cardiol，2010，7（10）：577584.

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（收稿日期：2014-12-17修回日期：2015-01-27）

（編輯：潘明志）endprint