侯婧瑛，向仍運，陳淑芬，于　鐘，吳淑云，王　林，王凌云△(中山大學(xué)附屬孫逸仙紀念醫(yī)院急診科，重癥醫(yī)學(xué)科，消化內(nèi)科，病理科，廣東廣州00;湘西自治州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南吉首6000)

Foxp3+Tregs和PD1在胃癌組織中的表達及其臨床病理意義*

侯婧瑛1，向仍運2，陳淑芬3，于鐘4，吳淑云4，王林5，王凌云4△
(中山大學(xué)附屬孫逸仙紀念醫(yī)院1急診科，3重癥醫(yī)學(xué)科，4消化內(nèi)科，5病理科，廣東廣州510120;2湘西自治州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南吉首416000)

目的:探討胃癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Foxp3+Tregs)與程序性死亡受體1(PD1)的表達情況及兩者與胃癌患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系。方法:采用免疫組織化學(xué)方法檢測111例胃癌患者癌組織和20例正常胃黏膜組織中Foxp3+Tregs及PD1的表達情況，分析胃癌組織中兩者的表達與患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系及兩項指標之間的相關(guān)性。結(jié)果:胃癌組織中Foxp3+Tregs和PD1表達增加，PD1表達于腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs)，兩者的表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P＜0. 05)，而與其它臨床病理因素如腫瘤大小、病理類型，病變部位均無關(guān)，以上指標表達陽性者總體生存率低(P＜0. 05)，預(yù)后差。胃癌組織中Foxp3+Tregs與PD1+TILs的表達之間存在顯著的正相關(guān)(P＜0. 01)。結(jié)論:胃癌組織中存在Foxp3+Tregs和PD1+TILs共同表達，二者可作為判斷胃癌患者疾病進展及預(yù)后的生物學(xué)標志物。

胃癌; Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞;程序性死亡受體1;腫瘤浸潤性淋巴細胞;臨床病理;預(yù)后

［ABSTRACT］AIM: To investigate the expression of Foxp3+regulatory T cells (Foxp3+Tregs) and programmed death receptor 1 (PD1) in gastric cancer tissues and their association with clinicopathological factors and prognosis of the patients.The correlation between the 2 molecules was also analyzed at the same time.METHODS: The tumor sections from 111 gastric cancer patients were stained for Foxp3 and PD1 by the method of immunohistochemistry.The associations of the expression levels of these 2 molecules with clinicopathological factors involved in the disease progression and prognosis were statistically analyzed.The relationship of their expression was detected.RESULTS: Foxp3+Tregs and PD1 were expressed in the gastric cancer tissues，and PD1 was expressed in the tumor infiltrating lymphocytes (TILs).The expression of Foxp3 and PD1 was correlated with lymph node metastasis，clinicopathological stage and prognosis of gastric cancer patients.The expression of these 2 determinants in the patients with lymph node metastasis and an advanced clinicopathological stage was distinctly higher (P＜0. 05).The patients with positive expression of the 2 indexes presented a lower overall survival rate and worse prognosis (P＜0. 05).A significantly positive correlation between the infiltration of Foxp3+Tregs and the expression of PD1+TILs was also observed (P＜0. 01).CONCLUSION: Foxp3+Tregs and PD1+TILs coinfiltrate in the gastric cancer tissues，which can be used as biological markers to predict the disease progression and prognosis.

［KEY WORDS］Gastric cancer; Foxp3+regulatory T cells; Programmed death receptor 1; Tumor infiltrating lymphocytes; Clinicopathology; Prognosis

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)資料顯示，全球每年約有64萬人因胃癌死亡，位居癌癥死因的第2位［1］。由于早期胃癌癥狀無特異性，而當癥狀明顯時病變已屬晚期，因此大部分胃癌確診時多為進展期胃癌，惡性程度高，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。因此，深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找治療的新靶點，以預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移從而改善患者的預(yù)后意義重大。

調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)在免疫耐受中起著至關(guān)重要的作用，其中CD4+CD25+Tregs最受關(guān)注［2］，是造成腫瘤免疫逃逸的重要機制之一，其特異性標記為叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3)。研究表明多種腫瘤患者外周血及腫瘤局部組織中存在Tregs數(shù)量及比例升高，從而抑制了腫瘤免疫反應(yīng)，加速了腫瘤生長，降低了患者的生存率［3］。應(yīng)用治療性腫瘤疫苗的同時清除體內(nèi)的Tregs能夠明顯增強抗腫瘤治療的效果［4］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中存在Tregs比例的顯著增高［5-6］。因此，闡明Tregs在胃癌中的調(diào)節(jié)機制對于尋求更為有效的針對胃癌的抗腫瘤免疫治療策略至關(guān)重要。

程序性死亡受體1(programmed death receptor 1，PD1)是CD28家族的成員之一，它能夠通過與其配體相互作用引起活化的T細胞凋亡從而發(fā)揮負向免疫調(diào)控效應(yīng)［7］。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)PD1在多種腫瘤組織的腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)中高表達并介導(dǎo)了疾病的不良預(yù)后［8-9］。研究表明PD1與Tregs產(chǎn)生和功能維持相關(guān)［7］。而目前PD1的表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確，PD1在胃癌組織中的表達如何及其與Tregs具有怎樣的關(guān)系亦尚未見研究報道。本研究的目的在于檢測胃癌患者腫瘤組織中Foxp3+Tregs與PD1的表達情況并進一步分析兩者與胃癌臨床病理和預(yù)后的關(guān)系，同時探討兩者表達之間的相關(guān)性。以為胃癌的早期診治及尋求新的抗腫瘤免疫治療策略提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1病例收集

實驗組來源于2007年7月～2011年2月期間在中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院進行手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理證實為胃癌的初治患者111例，所有患者術(shù)前均未行放療、化療并排除同時有自身免疫性疾病及免疫抑制劑使用病史者(本實驗符合中山大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會的相關(guān)規(guī)定)。111例胃癌患者臨床病理特點見表1。111例均獲得完全隨訪，隨訪日期截至2011年9月，其中生存66例，死亡45例。對照組來源于同期經(jīng)病理證實為胃潰瘍并因發(fā)生穿孔而行穿孔修補術(shù)的術(shù)后正常胃黏膜組織20例。其中男16例，女4例。年齡13～74歲，平均年齡47歲，中位年齡54歲。

表1　111例胃癌患者臨床病例特點Table 1.Clinicopathological characteristics of 111 gastric cancerpatients

2試劑

Foxp3兔抗人多克隆抗體(Sigma) ; PD1兔抗人多克隆抗體(Abcam) ;通用型免疫組化試劑盒、3，3-二氨基苯聯(lián)胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑Ⅰ抗稀釋液(中杉金橋)。

3免疫組化染色方法

采用免疫組織化學(xué)SP三步法，將111例胃癌患者石蠟標本4 μm連續(xù)切片，烤干后備用。石蠟切片常規(guī)二甲苯，梯度乙醇，脫蠟至水，用pH = 6的檸檬酸鹽持續(xù)沸騰狀態(tài)熱修復(fù)20 min后，室溫冷卻;磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)洗5 min，重復(fù)3次;阻斷劑3%過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)去內(nèi)源性過氧化酶，室溫15 min; PBS洗5 min，重復(fù)3次;加封閉液(正常山羊血清)室溫封閉15 min;傾去封閉液，(勿洗)滴加Ⅰ抗，4℃過夜; PBS洗5分，重復(fù)3次;滴加生物素標記的抗鼠/兔IgG的Ⅱ抗(試劑C)，室溫20分鐘; PBS洗5 min，重復(fù)3 次;滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白(試劑D)室溫20 min; PBS洗5 min，重復(fù)3次;滴加顯色劑DAB，光鏡下觀察，顯色適當后用水終止;蘇木素復(fù)染細胞核，水洗;脫水、透明、中性樹膠封片。

4結(jié)果判斷

陽性結(jié)果判定:細胞胞漿、胞核和(或)胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。PD1在TILs中表達，為胞膜或胞漿陽性; Foxp3在TILs表達，為胞核陽性。選擇切片中富含淋巴細胞的區(qū)域，高倍視野下記錄5個視野，計數(shù)表達陽性的淋巴細胞的個數(shù)，每個視野計數(shù)3次，取5個視野陽性細胞的均數(shù)作為表達陽性的淋巴細胞的數(shù)目，同時計數(shù)陽性淋巴細胞占總的TILs的百分比，每個視野計數(shù)3次，并將所得的5個視野陽性細胞百分比均值作為陽性細胞表達的百分數(shù)，陽性淋巴細胞數(shù)目占總的TIL超過5%為相應(yīng)的指標表達陽性。

5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13. 0進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料2組間比較采用兩獨立樣本的秩和檢驗(Mann-Whitney 法)，定性資料的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，定性資料的相關(guān)性分析采用χ2檢驗，用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗逐一分析各變量與患者術(shù)后生存的關(guān)系，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Figure 1.Immunohistochemical staining for Foxp3+Tregs derived from the tumor tissues of gastric cancer patients (×200).A: the positive expression of Foxp3+Tregs (nuclear，brown color) in the tumor tissues by immunohistochemical staining; B: immunohistochemical staining of Foxp3+Tregs in the normal tissues.圖1　Foxp3+Treg在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達情況

表2　111例胃癌患者胃癌組織中Foxp3+Tregs的表達與臨床病理的關(guān)系Table 2.Correlation between expression of Foxp3+Tregs and clinicopathological parameters of 111 gastric cancer patients

結(jié)果

1Foxp3+Tregs在胃癌組織中的表達及與患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系

111例胃癌患者Foxp3+Tregs陽性表達者77例，陽性表達率為69. 40%，胃癌組織中Foxp3+Tregs平均數(shù)目為7. 18±0. 68，占總TILs的平均比例為(11. 02±7. 86) %，正常胃黏膜組織中未見Foxp3+Tregs表達。胃癌組織中Foxp3+Tregs浸潤的陽性細胞數(shù)目高于正常胃黏膜組織(P＜0. 01)，見圖1。Foxp3+Tregs表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P＜0. 05)，與其它臨床病理因素無關(guān)(P＞0. 05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、TNM分期越晚，F(xiàn)oxp3+Tregs表達的陽性率越高(表2)。生存分析結(jié)果顯示本組胃癌患者胃癌組織中Foxp3+Tregs表達與患者術(shù)后生存情況相關(guān)，F(xiàn)oxp3+Tregs表達陽性者總體生存率低，預(yù)后差，見圖2。

2PD1在胃癌組織中的表達情況及與胃癌患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系

PD1表達于TILs，111例胃癌患者PD1+TILs陽性表達者72例，陽性表達率為64. 86%，胃癌組織中平均數(shù)目為9. 66±0. 42，占總TILs的平均比例為

(29. 44±0. 26) %，正常胃黏膜組織中未見表達。胃癌組織中PD1+TILs數(shù)目顯著高于正常胃黏膜組織(P＜0. 01)，見圖3。PD1+TILs表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P＜0. 05)，與其它臨床病理因素無關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者及TNM分期越晚，PD1+TILs表達的陽性率越高(表3)。生存分析結(jié)果顯示本組胃癌患者胃癌組織中PD1+TILs的表達與患者術(shù)后生存相關(guān)，表達陽性者總體生存率低，預(yù)后差(圖4)。

Figure 2.The Kaplan-Meier curve for the overall survival of 111 gastric cancer patients based on the expression of Foxp3+Tregs in the tumor tissues.Correlation of Foxp3+Tregs expression with the overall survival of 111 gastric cancer patients was checked with the logrank test.圖2　111例胃癌患者胃癌組織Foxp3+Tregs的表達與患者術(shù)后生存的關(guān)系

Figure 3.Immunohistochemical staining for PD1+TILs derived from the tumor tissues of gastric cancer patients (×200).A: the positive expression of PD1+TILs (membrane and cytoplasm，brown color) in the tumor tissues by immunohistochemical staining; B: immunohistochemical staining of PD1+TILs in the normal tissues.圖3　PD1+TILs在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達情況

表3　111例胃癌患者胃癌組織中PD1+TILs的表達與患者臨床病理的關(guān)系Table 3.Correlation between expression of PD1+TILs and clinicopathological parameters of 111 gastric cancer patients

Figure 4.The Kaplan-Meier curve for the overall survival of 111 patients with gastric cancer based on the expression of PD1+TILs in the tumor tissues.Correlation of PD1+TILs expression with the overall survival of 111 gastric cancer patients was checked with the log-rank test.圖4　111例胃癌患者胃癌組織PD1+TILs的表達與患者術(shù)后生存的關(guān)系

3胃癌組織Foxp3+Tregs浸潤與PD1+TILs表達與之間的相關(guān)性

本組胃癌患者胃癌組織中Foxp3+Tregs的浸潤與PD1+TILs的表達存在正相關(guān)性(P＜0. 01)，PD1+TILs表達陽性組的患者，其Foxp3+Tregs的陽性表達率亦顯著增高(P＜0. 01)，見表4。

表4　111例胃癌患者胃癌組織Foxp3+Tregs與PD1+TILs的表達與之間的相關(guān)性Table 4.Correlation between infiltration of Foxp3+Tregs and expression of PD1+TILs in the tumor tissues of 111 gastric cancer patients

討論

Foxp3+Tregs是一群具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，在抑制免疫反應(yīng)和維持機體免疫耐受中發(fā)揮著重要作用［2］。Foxp3已被證實是Tregs發(fā)育、分化和功能維持中的一個至關(guān)重要的決定性因子［10］。多項研究表明腫瘤患者外周血及腫瘤局部微環(huán)境中存在Tregs數(shù)量及比例升高，且這種現(xiàn)象直接介導(dǎo)了自身免疫效應(yīng)細胞對腫瘤的免疫耐受，并與腫瘤的進展程度及不良預(yù)后密切相關(guān)［3］。我們的前期研究表明胃癌患者外周血中Tregs比例顯著增高，并與患者臨床病理存在相關(guān)性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和TNM分期越晚，Tregs表達率越高，切除原發(fā)腫瘤后機體內(nèi)Tregs水平有所下降，復(fù)發(fā)時增加，Tregs比例對判斷胃癌病期及預(yù)后有一定價值［5-6］。Perrone等［11］對胃癌患者進行的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)Foxp3高表達的患者根治術(shù)后預(yù)后較差。在本研究中，胃癌患者腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達顯著增加，并且其表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及TNM分期越晚，F(xiàn)oxp3+Treg表達的陽性率明顯增高，表明Foxp3+Tregs在胃癌組織中的表達介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸，從而導(dǎo)致了疾病進展。生存分析結(jié)果顯示Foxp3+Tregs的表達與患者術(shù)后生存相關(guān)，表達陽性者術(shù)后總體生存率低，預(yù)后差，提示Foxp3+Tregs可作為判斷胃癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標。

PD1作為免疫球蛋白超家族成員之一，是一類分子量為50～55 kD的I型跨膜糖蛋白。它可被誘導(dǎo)表達于多種免疫細胞，包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞和單核細胞等［7］，對T細胞的增殖和功能起負向調(diào)節(jié)作用。PD1信號通過多種機制抑制T細胞免疫，如抑制自身反應(yīng)性初始T細胞向效應(yīng)T細胞轉(zhuǎn)化、直接抑制效應(yīng)T細胞、誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞向Tregs轉(zhuǎn)化以及通過激活Tregs或DC等來抑制效應(yīng)T細胞，而對PD1信號通路進行阻斷后能夠逆轉(zhuǎn)其介導(dǎo)的T細胞功能失調(diào)。目前已有多項證據(jù)表明阻斷PD1途徑是一個有效的抗腫瘤免疫治療手段。研究證實在動物實驗中對PD1或其配體進行阻斷可增強腫瘤特異性T細胞反應(yīng)，增強效應(yīng)T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用從而抑制腫瘤細胞增殖［12］?，F(xiàn)已在多種腫瘤組織中檢測到PD1的表達。PD1在TILs中的表達介導(dǎo)了腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制效應(yīng)并促進了腫瘤進展。研究表明在乳腺癌和腎癌組織中PD1在TILs表面的高表達介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸及患者的不良預(yù)后［8-9］。另有研究發(fā)現(xiàn)PD1在黑色素瘤患者的外周血和腫瘤組織中的TILs表面呈高表達，引起效應(yīng)T細胞的耗竭和功能障礙，并拮抗抗腫瘤免疫反應(yīng)［13］。不僅如此，現(xiàn)已有臨床研究運用相應(yīng)抗體對PD1途徑進行阻斷以達到抗腫瘤免疫治療的目的。在對多種實體腫瘤進行的研究中發(fā)現(xiàn)，運用PD1抗體間歇性治療在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌及非小細胞肺癌及腎癌的患者中均表現(xiàn)出較好的耐受性及一定的抗腫瘤效應(yīng)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)PD1在胃癌組織的TILs中呈現(xiàn)高表達，并且其表達與及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及TNM分期越晚，PD1+TILs表達率越高。生存分析結(jié)果顯示PD1+TILs陽性組總體生存率顯著降低。我們推斷胃癌組織中PD1在TILs的高表達抑制了TILs的增殖和活化并誘導(dǎo)T細胞無能，從而引起胃癌細胞的免疫耐受，并使其逃避機體的免疫監(jiān)控，導(dǎo)致了患者的疾病進展及不良預(yù)后，PD1+TILs可以作為評估胃癌預(yù)后的一個指標。

PD1與Tregs的擴增和功能維持密切相關(guān)。研究證實PD1在TILs中的表達上調(diào)能夠增強Tregs的免疫抑制功能［15］。Ghebeh等［16］對乳腺癌的研究顯示腫瘤組織中PD1+TILs的表達與Foxp3+Tregs呈正相關(guān); Kang等［9］對腎癌的研究發(fā)現(xiàn)PD1+TILs表達與Tregs在瘤體內(nèi)浸潤亦呈顯著正相關(guān); French等［17］發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中存在PD1+TILs高表達，并與Tregs浸潤呈正相關(guān)。PD1/程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PDL1)通路能夠誘導(dǎo)Foxp3的表達，阻斷PD1信號能夠抑制Foxp3+Tregs的增殖［18］。研究發(fā)現(xiàn)PD1/ PDL1通路在DCs誘導(dǎo)的Tregs的擴增中發(fā)揮重要作用。PDL1在耐受性樹突狀T細胞(tolerance dendri-tic T cells，Tol-DCs)表面的表達上調(diào)能夠刺激Foxp3+Tregs的擴增［19］.。Duraiswamy等［18］對卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1/PD-L1通路能夠增強TILs的擴增和其功能，同時抑制Tregs的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中Foxp3+Tregs和PD1+TILs的表達均明顯增加，并且兩者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及術(shù)后生存相關(guān)，兩者的表達增加介導(dǎo)了患者的疾病進展及不良預(yù)后。對Foxp3+Tregs和PD1+TILs的表達進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)兩者之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，我們推測胃癌組織中PD1+TILs的高表達可能參與調(diào)節(jié)Foxp3+Tregs的產(chǎn)生和其負向免疫調(diào)控功能的維持，因此對Foxp3+Tregs和PD1進行聯(lián)合阻斷將能夠在針對胃癌的抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮更好的效應(yīng)。到目前為止，腫瘤微環(huán)境中PD1對Tregs的具體調(diào)節(jié)作用及機制如何仍未明確，PD1的表達是否直接介導(dǎo)了Tregs的產(chǎn)生及通過何種途徑介導(dǎo)其產(chǎn)生仍有待進一步深入研究。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Expression of Foxp3+Tregs and PD1 in gastric cancer tissues and their correlation with clinicopathological factors and prognosis

HOU Jing-ying1，XIANG Reng-yun2，CHEN Shu-fen3，YU Zhong4，WU Shu-yun4，WANG Lin5，WANG Ling-yun4
(1Emergency Department，3Intensive Care Medicine Department，4Gastroenterology Department，5Pathology Department，The Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;2Gastroenterology Department of People’s Hospital of Xiangxi Autonomous Prefecture，Jishou 416000，China.E-mail: xzr020@aliyun.com)

R363; R730. 23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.003

1000-4718(2015)10-1744-06

2015-06-01

2015-07-10

廣東省科技社會發(fā)展項目(No.2012B031800362)

△Tel: 020-81332489; E-mail: xzr020@aliyun.com