孫洪新 ，張英杰 ，劉月琴，陳曉勇，敦偉濤

(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071000； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

綿羊CYP19基因卵巢啟動子的克隆及其表達活性研究

孫洪新1，2，張英杰1*，劉月琴1，陳曉勇2，敦偉濤2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071000； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

本研究旨在克隆綿羊CYP19基因卵巢啟動子序列片段，構(gòu)建真核表達載體，并在細胞水平檢測其組織特異性表達情況。參考已知序列設(shè)計特異性引物，PCR擴增綿羊CYP19基因卵巢啟動子1.1和0.5 kb兩個片段，并與已公布的序列進行同源性比較；將測序正確的兩個片段分別定向克隆到去除CMV的pEGFP-N2載體骨架中，構(gòu)建真核表達載體pCYP19-1.1-EGFP-N2和 pCYP19-0.5-EGFP-N2，重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導下，分別轉(zhuǎn)染綿羊的顆粒細胞和胎兒成纖維細胞，并于轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h觀察EGFP表達情況。結(jié)果表明，擴增獲得片段與已公布序列高度同源；應用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測軟件對所得序列分析表明，該擴增片段含有類似于TATA-box核心啟動順式元件，并含有多個潛在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。轉(zhuǎn)染24 h后，發(fā)現(xiàn)pCYP19-1.1-EGFP-N2在顆粒細胞可觀測到綠色熒光表達，48 h熒光細胞數(shù)量有所增加；轉(zhuǎn)染72 h時熒光細胞數(shù)最多；在胎兒成纖維細胞也有少量EGFP基因表達。pCYP19-0.5-EGFP-N2在顆粒細胞和成纖維細胞中均未檢測到熒光。結(jié)果表明，擴增所得的綿羊CYP19基因卵巢啟動子1.1 kb片段可引導外源基因在顆粒細胞中的表達，可用于與繁殖相關(guān)的基因功能及轉(zhuǎn)基因動物研究，但并非卵巢特異性啟動子。

綿羊；CYP19；卵巢啟動子；表達

CYP19基因?qū)儆赑450(Aromatase cytochrome P450 gene)超家族基因，是編碼芳香化酶P450 arom的基因。芳香化酶P450arom能夠催化睪酮和雄烯二酮不可逆的轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素生物合成中的關(guān)鍵酶和限速酶。該過程在魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及哺乳動物的性腺分化和性器官發(fā)育中是必不可少的，同時對腦的發(fā)育及功能也具有重要影響[1-3]。

CYP19基因有多個啟動子，由它們介導CYP19基因在不同組織中的表達。不同物種CYP19基因啟動子的數(shù)量和結(jié)構(gòu)有所區(qū)別，命名也不相同。人的CYP19基因位于染色體15q21.1區(qū)帶[4]，由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成[5]。迄今，已發(fā)現(xiàn)了人CYP19基因的10個組織特異性啟動子(P1.1、P1.2、P1.3、P1.4、P1.5、P1.6、P1.7、PII、P2a和P1.f)[4-5]，均位于外顯子2 5′端上游約93 kb 長的外顯子1區(qū)域[6-7]。綿、山羊和牛CYP19基因分別位于染色體7q24-q31、10q26和q2.6區(qū)帶，在牛羊也發(fā)現(xiàn)了多個組織特異性啟動子，其中牛上有7個P1.1、P1.2a、P1.3、P1.4、P1.5、P2、P1.2a/b[8-11]；羊CYP19基因啟動子P1.1、P1.4 、P1.5和P2[11]。在鼠類中僅發(fā)現(xiàn)了兩個啟動子。

CYP19基因的表達模式是選擇性地利用不同啟動子和相應的外顯子[12]，CYP19基因在不同物種和特定組織中的表達是通過選擇性的使用不同啟動子實現(xiàn)的。不同啟動子選擇性地把自身外顯子1 5′端非翻譯區(qū)域(5′UTR) 剪接到位于外顯子1翻譯起始位點(ATG) 上游處的剪切位點(AG/GACT)上，調(diào)控 P450arom mRNA水平。但是CYP19 基因編碼區(qū)是恒定的，無論剪切模式如何，不同組織CYP19基因所編碼的芳香化酶蛋白總是相同的[13]。不同啟動子的上游基因可以攜帶不同的調(diào)節(jié)基因，結(jié)合于該區(qū)域的核蛋白受組織類型和內(nèi)分泌環(huán)境的影響，物種的差異使基因在表達的各個環(huán)節(jié)中可能產(chǎn)生或多或少的差異，特定組織中CYP19基因的表達產(chǎn)物芳香化酶P450的含量、活性及其最終發(fā)揮的組織特異性功能各有不同。人胎盤中CYP19 基因主要采用 P1.1 進行轉(zhuǎn)錄[14]，其次是PI.2 和 P2a；在卵巢中PⅡ(反芻動物稱P2)是主要的啟動子；睪丸和前列腺中也主要是PⅡ特異的轉(zhuǎn)錄物，故PⅡ常被稱為生殖腺特異的啟動子[15]。人和嚙齒類黃體期主要的啟動子是PII[14，16]，而反芻動物主要為P1.1[17]。牛羊在妊娠過程中使用不同的啟動子引導CYP19基因的表達，牛胎盤和黃體中主要是P1.1，綿羊胎盤中主要是P1.5；黃體中是P1.1和P1.5。在水牛卵泡發(fā)育成熟和黃體化過程中存在啟動子的轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為P2下調(diào)，P1.1上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，該過程中CYP19基因組織特異性表達的變化和P2的組織特異性甲基化作用以及P1.1組蛋白修飾造成的染色質(zhì)重組相一致[18]。推測，卵泡發(fā)育形成和黃體化過程中，啟動子活性變化和P2的組織特異性甲基化作用以及P1.1組蛋白修飾造成的染色質(zhì)重組有關(guān)。但有關(guān)啟動子轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)CYP19基因組織特異性表達的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制還不清楚。

J.Zhou等[19]研究表明，乳腺癌細胞能通過促進 C/EBPb 與 PⅡ調(diào)控區(qū)域相結(jié)合上調(diào)CYP19基因在脂肪成纖維細胞中表達，-517～278 bp為 PⅡ基本活性區(qū)域，在-317～304 bp為CCAAT增強子結(jié)合區(qū)域，與乳腺癌細胞共培養(yǎng)后，能使-517 bp 啟動子活性上調(diào) 5.7 倍，而當通過定點突變CCAAT結(jié)合區(qū)域后，這一上調(diào)作用消失。M.Pannetier等[20]克隆了山羊卵巢特異性啟動子中不同長度的5個片段，pAro1(1 104 bp)、pAro2(507 bp)、pAro3(180 bp)、pAro4(110 bp)和pAro5(40 bp)，并構(gòu)建了熒光素酶報告基因載體(pCYP19-Luc)，進行了綿羊顆粒細胞轉(zhuǎn)染試驗。于今非等[21]克隆了水牛、黃牛CYP19啟動子0.9和1.6 kb各兩個片段，并構(gòu)建了真核表達載體在細胞水平進行檢測。結(jié)果顯示黃牛、水牛的CYP19啟動子(0.9 kb)可啟動EGFP在卵巢顆粒細胞中特異表達，但效率非常低。而有關(guān)綿羊CYP19基因啟動子P2完整序列及其在顆粒細胞中的特異轉(zhuǎn)錄活性研究未見報道。本研究旨在參考已知的CYP19基因啟動子P2序列，克隆綿羊CYP19 基因卵巢啟動子序列的不同區(qū)域片段，利用分子生物學軟件進行功能分析預測，并分別構(gòu)建真核表達載體，在細胞水平上對其活性進行檢測和比較，為與繁殖相關(guān)的轉(zhuǎn)基因動物研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pEGFP-N2質(zhì)粒為本實驗室保存，pMD-19T(Simple)載體、限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工，基因組提取試劑盒和大腸桿菌DH5a購自全式金公司。小尾寒羊卵巢和胎兒取自唐縣屠宰場。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵巢采集及DNA提取 小尾寒羊屠宰后立即取出雙側(cè)卵巢組織，放入液氮中，帶回實驗室備用。卵巢組織DNA提取按組織DNA試劑盒操作步驟進行。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已公布的綿山羊基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并在引物序列的正反兩端，分別添加AseI和NheI酶切位點，用于綿羊CYP19基因卵巢啟動子-683～-1 199 bp和-31～-1 130 bp擴增，預期片段大小為517和1 100 bp兩個片段，分別記為CYP19 P 0.5和CYP19 P 1.1。引物由上海生物工程公司合成，具體引物序列見表1。

表1 PCR引物

Table 1 Primers of PCR

引物Primer引物序列(5′?3′)Primerssequence產(chǎn)物長度/bpLengthofproductsCYP19P0．5kbATTAATACAATGGGAGGCTCTGAGAATGGCTAGCGAAAAATTAGAAAATCCCCAAA517CYP19P1．1kbATTAATCTGAGCCGCTTTCACTTTGCGCTAGCGAGATTGGCGCTTTGTTTTA1100

1.2.3 綿羊CYP19基因卵巢啟動子片段的擴增和克隆 PCR擴增反應體系為25 μL：其中引物1.0 μL；Mix 10 μL；DNA 1.0 μL；ddH2O 13 μL。CYP19 P 0.5 kb擴增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s ，72 ℃ 1.5 min，30 循環(huán)；72 ℃5 min。CYP19 P 1.1擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，35 循環(huán)；72 ℃10 min。

用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下，割取目的條帶，并用小量膠回收試劑盒回收，與PMD19TM(Simple)載體進行連接。轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。涂平板37 ℃過夜，挑取白色單菌落，在添加氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12 h，進行菌液PCR。對PCR為陽性的菌液進行質(zhì)粒小提，送北京華大生物公司進行測序。

1.2.4 克隆片段序列的生物信息學分析 利用BioEdit 7.0對克隆獲得的片段序列的峰圖進行比對，用ContingExpress進行序列拼接，利用 BLAST比較克隆序列與已知序列的同源性。采用TATA signal prediction(http：//zeus2.itb.cnr.it/webgene/wwhc-tata.html)以及轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(http：//mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)、MatInspector(www.genomatix.de)、 TRANSFAC(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs.html)、CpG島預測軟件(http：//www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx和http：//zeus2.itb.cnr.it/cgibin/wwwcpg.pl)軟件對克隆序列潛在的調(diào)控元件及其CpG島等進行分析，對其轉(zhuǎn)錄活性進行分析預測。

1.2.5 重組表達載體的構(gòu)建 將測序正確的含CYP19 1.1 kb和CYP19 0.5 kb片段的質(zhì)粒與pEGFP-N2質(zhì)粒載體分別應用AseI和NheI進行雙酶切，電泳獲得的片段與去除CMV的pEGFP-N2載體片段應用DNA凝膠試劑盒回收。用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接回收產(chǎn)物，之后轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)大腸桿菌，在卡那霉素抗性平板上挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，應用AseI和NheI進行酶切鑒定并測序。對酶切和測序結(jié)果均正確的樣品，用去除內(nèi)毒素的試劑盒進行質(zhì)粒中提，測定濃度后備用。構(gòu)建的載體分別命名為pCYP19-0.5-EGFP-N2和pCYP19-1.1-EGFP-N2。

1.2.6 細胞培養(yǎng)

1.2.6.1 胎兒成纖維細胞的原代培養(yǎng)和純化：取懷孕50日齡小尾寒羊胎兒，參照文獻[22]方法，進行細胞采集和培養(yǎng)。原代細胞采用DMEM/F12添加15%胎牛血清進行貼壁培養(yǎng)，細胞長成致密單層后，用0.25%胰酶消化，待大部分細胞變圓時，加培養(yǎng)液終止消化，并反復吹打，只收集脫壁細胞。成纖維細胞消化脫壁比上皮細胞快，待細胞剛變圓即終止消化，可得到純化的成纖維細胞。細胞生長至70%～80%匯合狀態(tài)時即可冷凍保存，以備基因轉(zhuǎn)染使用。

1.2.6.2 卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)：從屠宰場采集卵巢迅速放入37 ℃含雙抗的生理鹽水(100 IU·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1鏈霉素)的保溫瓶中帶回實驗室。將卵巢過75%乙醇，用預熱好的37 ℃生理鹽水洗滌卵巢3次。用消毒過的眼科剪將卵巢附帶的脂肪和結(jié)締組織剔除干凈，再用預熱好的37 ℃生理鹽水洗滌卵巢2次。用注射器連12號針頭吸37 ℃預熱的DMEM/F12 2 mL左右，吸取直徑為3～6 mm卵泡中的卵泡液，撿出結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，PBS 清洗干凈后，用0.1%透明質(zhì)酸酶作用，用移液槍輕輕吹打，挑出裸卵，將收集到的卵丘細胞1 000 r·min-1離心5 min，用適量含10%FBS的DMEM/F12(Hyclone)稀釋，制成顆粒細胞懸浮液，調(diào)整細胞濃度為1×105mL-1，接種于25 mL培養(yǎng)瓶(Corning)中，在37 ℃ 5%CO2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，用于后續(xù)的細胞轉(zhuǎn)染試驗。

1.2.7 脂質(zhì)體介導的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊細胞研究 細胞轉(zhuǎn)染使用 LipofectamineTMLTX + PLUS Reagent試劑盒進行。轉(zhuǎn)染前將G1代的小尾寒羊顆粒細胞和G3代的小尾寒羊胎兒成纖維細胞分別接種到6孔板中，進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長到 80%～90% 匯合度時，將重組質(zhì)粒pCYP19-1.1-EGFP-N2和pCYP19-0.5-EGFP-N2在脂質(zhì)體介導下，分別轉(zhuǎn)染兩種細胞。每組設(shè)3個重復。6孔板中每孔質(zhì)粒DNA 使用量為2.5 μg，脂質(zhì)體用量為12 μL，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明進行轉(zhuǎn)染。在125 μL細胞培養(yǎng)液中稀釋2.5 μg核酸，加入3 μL PLUS，輕輕混勻后備用，在125 μL細胞培養(yǎng)液中稀釋12 μL脂質(zhì)體。將上述2種稀釋液輕輕混合后在室溫下孵育5 min形成250 μL復合體。將復合體加入6孔板中，輕輕搖動混合。在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，更換10% FBS的DMEMF12培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，開始利用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP表達情況，待轉(zhuǎn)染72 h后，收集轉(zhuǎn)染細胞樣品，用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié) 果

2.1 CYP19 卵巢啟動子片段的擴增

以小尾寒羊卵巢DNA為模板，進行PCR擴增，用1.5%的瓊脂糖電泳進行檢測，擴增產(chǎn)物為約500和1 100 bp的片段(圖1)，條帶單一、清晰明亮，可用于后續(xù)試驗。

1、2．PCR產(chǎn)物；M.DL2000 DNA marker1，2 .PCR products；M.DL2000 DNA marker圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products

2.2 CYP19 卵巢啟動子片段克隆及測序

將電泳得到的兩個片段分別進行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，克隆入PMD19TM(Simple)，提取陽性質(zhì)粒，送上海生工測序。利用ContingExpress、BioEdit和Chromas軟件對測序結(jié)果進行分析和拼接，結(jié)果獲得了1 100 bp(1.1 kb)和517 bp(0.5 kb)的序列。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)克隆得到的兩個序列與已有序列高度同源。其中1.1 kb序列片段與DQ122857序列的同源性達98.92%。517 bp片段與已公布的綿羊序列AJ012144.1完全一致，相似度達到100%，與已知山羊序列的同源性為99.34%。克隆小尾寒羊CYP19卵巢啟動子片段(1.1 kb)與部分已知序列的同源性比對結(jié)果見圖2。

圖2 克隆小尾寒羊CYP19卵巢啟動子片段與部分已知序列的同源性比對Fig.2 The homology of cloning CYP19 ovarian promoter fragment of small-tailed han sheep with some known sequence

2.3 擴增序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

CpGIsland Searcher和CpG Island Prediction工具預測，發(fā)現(xiàn)克隆得到的兩個片段區(qū)域無符合條件的CpG島。進一步應用TFSEARCH(http：//mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)、TRANSFAC(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs.html)和MatInspector(www.genomatix.de) 軟件對1 100和517 bp片段序列進行分析表明，具有類似于TATA-box、Oct-1等啟動子的特征元件和多個C/EBPbeta、NF5、CRE、FOXL2、GATA-1、SRY、 AP1、MZF1等調(diào)控元件結(jié)合位點。部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點見圖3。

圖3 克隆1.1 kb序列及部分潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件Fig.3 Nucleotide sequence of the 1.1 kb and partial transcriptional regulation sequences

2.4 重組載體的構(gòu)建及鑒定

將酶切后的目的片段與去除CMV的pEGFP-N2線性化片段進行連接構(gòu)建表達載體。過夜連接后轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，隨機挑取10個克隆進行PCR檢測，對陽性克隆菌液進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用AseI和NheI進行酶切和測序，電泳酶切產(chǎn)物結(jié)果產(chǎn)生1.1 kb與4.1 kb和517 bp片段(圖4)，測序結(jié)果正確，表明CYP19 P0.5、CYP19 P1.1已成功克隆入去掉CMV的pEGFP-N2質(zhì)粒，pCYP19-0.5-EGFP-N2和 pCYP19-1.1-EGFP-N2載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒圖譜見圖5。

1、2.雙酶切產(chǎn)物；M.DL5000 DNA marker；3.質(zhì)粒對照1,2.Double enzyme products；M.DL5000 DNA marker;3.Plasmid control圖4 pCYP19-0.5-EGFP-N2和pCYP19-1.1-EGFP-N2的雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pCYP19-0.5-EGFP-N2 and pCYP19-1.1-EGFP-N2

圖5 重組質(zhì)粒圖譜Fig.5 Vector map of recombinant plasmid

2.5 重組質(zhì)粒在綿羊細胞中的表達

pCYP19-0.5-EGFP-N2和pCYP19-1.1-EGFP-N2分別經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS包埋后，瞬時轉(zhuǎn)染綿羊卵巢顆粒細胞和胎兒成纖維細胞。轉(zhuǎn)染24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細胞內(nèi)的綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，報告基因開始表達，48 h后細胞熒光亮度有所增加，隨著轉(zhuǎn)染時間延長，陽性細胞數(shù)增多，72 h后最多。在綿羊胎兒成纖維細胞中也觀察到了類似有少量綠色熒光表達(圖6和7)，表明克隆CYP19 1.1 kb(-31～-1 130 bp)序列具有生物學活性。而pCYP19-0.5-EGFP-N2經(jīng)LipofectamineTMLTX+PLUS介導轉(zhuǎn)染小尾寒羊顆粒細胞和胎兒成纖維細胞后，均未觀察到熒光，表明克隆0.5 kb(-683～-1 199 bp)無轉(zhuǎn)錄活性，啟動子關(guān)鍵活性部位未包含在該區(qū)域中。

收集轉(zhuǎn)染72 h后的顆粒細胞，以空白作對照，用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。pCYP19-1.1-EGFP-N2轉(zhuǎn)顆粒細胞的平均轉(zhuǎn)染效率為41.66%，轉(zhuǎn)小尾寒羊胎兒成纖維細胞的平均轉(zhuǎn)染效率為20.16%。流式細胞儀測定結(jié)果見圖8。

3 討 論

本試驗成功克隆了綿羊CYP19基因卵巢啟動子的1.1和0.5 kb兩個片段，對所得序列進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了類似于TATA-box的啟動子的特征元件和多個C/EBP、SRY、MZF-1、AP-1、GATA-1等若干對表達調(diào)控具有重要作用的序列元件。進一步將該序列與pEGFP-N2基因載體融合，替換掉該載體中的CMV啟動子序列，成功構(gòu)建了pCYP19-0.5-EGFP-N2和 pCYP19-1.1-EGFP-N2。利用脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導，分別轉(zhuǎn)染綿羊卵巢顆粒細胞和胎兒成纖維細胞。發(fā)現(xiàn)經(jīng)pCYP19-1.1-EGFP-N2轉(zhuǎn)染后在卵巢顆粒細胞和成纖維細胞中均有綠色熒光表達，而pCYP19-0.5-EGFP-N2在綿羊卵巢顆粒細胞和胎兒成纖維細胞中均未檢測到熒光，意味著pCYP19- 1.1-EGFP-N2在顆粒細胞和成纖維細胞中均具有表達活性，能引導外源基因在其中的特異表達；而pCYP19-0.5-EGFP-N2不具有表達活性，調(diào)控綿羊CYP19基因卵巢啟動子表達的核心序列區(qū)域不含在此0.5 kb(-683～-1 199 bp)序列。

研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢特異性啟動子的近端含有許多保守調(diào)控元件結(jié)合位點，如調(diào)控cAMP 信號通路的類cAMP反應元件序列((cAMP response element)-like sequence；CLS)[23-24]、孤核轉(zhuǎn)錄因子NR5A1/NR5A2和叉頭框家族FOXL2[25]、AP3(Activation protein 3)和GATA結(jié)合位點等。研究證實，在卵巢不同種類的細胞中這些順式作用元件起著不同的作用，對克隆1.1 kb序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析預測表明，1.1 kb也包含有CRE、NR5A1/NR5A2和叉頭框家族FOXL2等調(diào)控元件結(jié)合位點，預示克隆片段具有卵巢特異性啟動子活性。此外， FOXL2在不同物種間的作用不同，在人和小鼠中，表現(xiàn)為抑制PII活性[26-27]，在山羊中則表現(xiàn)為促進P2活性[20]。盡管本試驗克隆的1.1 kb和山羊P2以及牛PII高度同源，但仍存在一些單堿基變異，這些變異可能會導致一些未知潛在調(diào)控元件結(jié)合位點的變化，進而影響其活性和卵巢表達的特異性。C.H.Tu等[28]報道，能夠在卵巢組織中特異表達的啟動子僅有OSP-1、OSP-2。CYP19、抑制素a(Inhibin a)和苗勒管抑制物質(zhì)Il型受體(Mulledan inhibiting substance typeII receptor，MISIIR)等針對卵巢的特異性啟動子除了能調(diào)控基因在卵巢組織高效表達外，在其它組織也有相當水平的啟動功能，缺乏高度專一性。pCYP19-1.1-EGFP-N2在顆粒細胞和成纖維細胞中轉(zhuǎn)染效率的不同，顯示克隆所得1.1 kb卵巢啟動子在組織特異性上缺乏高度專一性。有研究發(fā)現(xiàn)，人CYP19基因外顯子2的P2 啟動子可以啟動標記基因在性腺組織的特異表達[29]。本試驗克隆得到的綿羊CYP19基因卵巢啟動子的1.1 kb雖具有活性，但并非真正卵巢特異性表達。M.Margaret等[30]克隆了PIIa 43、278和2 700 bp不同長度的啟動子片段，并連接人生長激素基因作為表達基因，制備了轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示，278和 2 700 bp兩種片段的小鼠在腦、腎、肺、肝、皮膚、大腦、卵巢等臟器中均有表達，P II a43只在卵巢特異表達，并在雌性小鼠中，該啟動子將目的基因定位在顆粒細胞、黃體以及黃體化間質(zhì)細胞上。而將轉(zhuǎn)基因小鼠組織表達分析得知，278 bp片段表達程度較2 700 bp的片段高，而43 bp片段沒有表達，說明調(diào)控外顯子PIIa卵巢特異表達的區(qū)域在43～278 bp。由此推斷，調(diào)控CYP19基因卵巢特異表達的核心、關(guān)鍵區(qū)域可能集中在1.1 kb序列的某一區(qū)域。

A.轉(zhuǎn)染24 h； B.轉(zhuǎn)染48 h；C.轉(zhuǎn)染72 h。下同A.Transfection for 24 h;B.Transfection for 48 h;C.Transfection for 72 h.The same as Fig.7圖6 pCYP19-0.5-EGFP-N2轉(zhuǎn)染綿羊顆粒細胞100×Fig.6 The transfection of pCYP19-0.5-EGFP-N2 in sheep granulosa cells 100×

圖7 pCYP19-1.1-EGFP-N2轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞100×Fig.7 The transfection of pCYP19-1.1-EGFP-N2 in sheep fetal fibroblast cells 100×

A.顆粒細胞；B.成纖維細胞A.Granulose cells；B.Fetal fibroblast cells圖8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顆粒細胞和成纖維細胞72 h流式圖Fig.8 The transfection of CYP191.1 in granulose cells and fetal fibroblast cells for 72 h assayed by flow cytometry

本研究僅克隆了綿羊CYP19基因卵巢啟動子的1.1和0.5 kb兩個片段，對其調(diào)控元件的分析僅限于推測，其活性研究僅限于綿羊顆粒細胞和成纖維細胞的體外嘗試。有關(guān)CYP19基因啟動子1.1 kb片段的活性功能驗證還有待于在更多種類細胞進行試驗。要確定綿羊CYP19基因卵巢啟動子的核心區(qū)域，尤其是在卵巢中特異表達的區(qū)域，還需進一步研究證實。

[1] GUIGUEN Y，F(xiàn)OSTIER A，PIFERRER F，et al.Ovarian aromatase and estrogens：A pivotal role for gonadal sex differentiation and sex change in fish[J].GenCompEndocrinol，2010，165(3)：352-366.

[2] KELLER J M,MCCLELLAN-GREEN P.Effects of organochlorine compounds on cytochrome P450 aromatase activity in an immortal sea turtle cell line[J].MarEnvironRes，2004(58)：347-351.

[3] GYLLENHAMMAR I，ERIKSSON H，SODERQVIST A，et al.Clotrimazole exposure modulates aromatase activity ingonads brain during gonadal differentiation in Xenopus tropicalis frogs[J].AquaticToxicol，2009，91(2)：102-109.

[4] CHEN S A，BESMAN M J，SPARKES R S，et a1．Human aromatase：cDNA cloning，Southern blot analysis，and assignment to the gene to chromosomel 5[J].DNA，1988，7(1)：27-38.

[5] MAHENDROO M S，MENDELSON C R，SIMPSON E R．Tissue-specific and hormonally-controlled alternative promoters regulate aromatase cytochrome P450 gene expression in human adipose tissue[J].BiolChem，1993(268)：19463-19470．

[6] SEBASTIAN S，TAKAYAMA K，SHOZU M，et al.Cloning and characterization of a novel endothelial promoter of the human CYP19(Aromatase P450) gene that is up-regulated in breast cancer tissue[J].MolEndocrinol， 2002，16(10)：2243-2254.

[7] BULUN S E，SEBASTIAN S，TAKAYAMA K，et al.The human CYP19(aromatase P450) gene：update on physiologic roles and genomic organization of promoters[J].SteroidBiochemMolBiol，2003，86(3-5)：219-224.

[8] HINSHELWOOD M M，LIU Z，CONLEY A J，et al.Demonstration of tissue-specific promoters in nonprimate species that express aromatase P450 in placentae[J].BiolReprod，1995，53(5)：1151-1159.

[9] FüRBASS R，KALBE C，VANSELOW J.Tissue-specific expression of the bovine aromatase encoding gene uses multiple transcriptional start sites and alternative first exons[J].Endocrinology，1997，138(7)：2813-2819.

[10] VANSELOW J，ZSOLNAI A，F(xiàn)ESüS L，et al.Placenta-specific transcripts of the aromatase encoding gene include different untranslated first exons in sheep and cattle[J].EurJBiochem，1999(265)：318-324.

[11] 王金玲，王 永，鄭玉才，等.草地藏系綿羊CYP19基因第9內(nèi)含子和啟動子2多態(tài)性分析[J].綿陽師范學院學報，2009，28(5)：64-66. WANG J L，WANG Y，ZHENG Y C，et al.Polymorphism of the intron 9 and promoter 2 ofCYP19 gene in Tibetan sheep[J].JournalofMianyangNormalUniversity(NaturalScienceEdition)，2009，28(5)：64-66.(in Chinese)

[12] SIMPSON E R，ZHAO Y，AGARWAL V L，et al．Aromatase expression in health and disease[J].RecProgHormRes，1997(52)：185-214.

[13] SIMPSON E R，CLYNE C，RUBIN G，et al.Aromatase——a brief overview[J].AnnuRevPhysiol，2002(64)：93-127.

[14] MEANS G D，KILGORE M W，MAHENDROO M S，et al.Tissue-specific promoters regulate aromatase cytochrome P450 gene expression in human ovary and fetal tissues[J].MolEndocrinol，1991(5)：2005-2013.

[15] KATSUMI T，SATOSHI N，YUTAKAS S.Identification and characterization of transcriptional regulatory elements of the human aromatase cytochrome P450 gene[J].SteroidBiochemMolBiol， 1996，56(1)：151-159.

[16] STOCCO C.Invivoandinvitroinhibition of cyp19 gene expression by prostagland in F2a in murine luteal cells：implication of GATA-4[J].Endocrinology，2004，145(11)：4957-4966.

[17] LENZ S，P HLAND R，BECKER F，et al.Expression of the bovine aromatase cytochrome P450 gene(CYP19) is primarily regulated by promoter 2 in bovine follicles and by promoter 1.1 in corpora lutea[J].MolReprod，2004，67(4)：406-413.

[18] MONGA R，GHAI S，DATTA T K，et al.Tissue-specific promoter methylation and histone modification regulateCYP19 gene expression during folliculogenesis and luteinization in buffalo ovary[J].GenCompEndocrinol，2011，173(1)：205-215.

[19] ZHOU J，GURATES B，YANG S，et al.Malignant breast epithelial cells stimulate aromatase expression via promoterⅡin human adipose fibroblasts：an epithelial-stromal interaction in breast tumors mediated by CCAAT/Enhancer binding proteinbeta[J].CancerRes， 2001，61(5)：2328-2334.

[20] PANNETIER M，F(xiàn)ABRE S，BATISTA F，et al.FOXL2 activates P450 aromatase gene transcription：towards a better characterization of the early steps of mammalian ovarian development[J].MolEndocrinol， 2006，36(3)：399-413.

[21] 于今非.CYP19和OSP-1卵巢特異表達啟動子克隆與檢測[D].南寧：廣西大學，2010. YU J F.Cloning and expression assay of ovarian specific expressing promoter：OSP-1 and CYP19[D].Nanning：Guangxi University，2010.(in Chinese)

[22] 斯佩克特D L，戈德曼R D，苯因萬德L A.細胞實驗指南[M].黃培堂，譯.北京：科學出版社，2003. SPECTOR D L，GOLDMAN R D，LEINWAND L A.Cells：A laboratory manual[M].HUANG P T，Translation.Beijing：Science Press，2003.(in Chinese)

[23] FITZPATRICK S L，RICHARDS J S.Regulation of cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid and activity by steroids and gonadotropins in rat granulosa cells[J].Endocrinology，1991，129(3)：1452-1462.

[24] MICHAEL M D，MICHAEL L F，SIMPSON E R.A CRE-like sequence that binds CREB and contributes to cAMP-dependent regulation of the proximal promoter of the human aromatase P450(CYP19) gene[J].MolCellEndocrinol，1997，134(2)：147-156.

[25] STOCCO C.Aromatase expression in the ovary：hormonal and molecular regulation[J].Steroids，2008，73(5)：473-487.

[26] KUO F T，BENTSI-BARNES I K，BARLOW G M，et al.Mutant Forkhead L2(FOXL2) proteins associated with premature ovarian failure(POF) dimerize with wild-type FOXL2，leading to altered regulation of genes associated with granulosa cell differentiation[J].Endocrinology，2011，152(10)：3917-3929.

[27] KUO FT，F(xiàn)AN K，BENTSI-BARNES I，et al.Mouse forkhead L2 maintains repression of FSH-dependent genes in the granulosa cell[J].Reproduction，2012，144(14)：485-494.

[28] TU C H，LIU W P，HUANG L L.Cloning and transcriptional activity of a novel ovarian-specific promoter from rat retrovirus-like elements[J].ArchBiochemBiophys，2009，485(1)：24-29.

[29] MEANS G D，MAHENDROO M.Structural analysis of the gene encoding human aromatase cytochrome P450，the enzyme responsible for estrogen biosynthesis[J].BiolChem，1989，264(32)：19385-19391．

[30] HINSHELWOOD M M，MENDELSON C R.Tissue-specific expression of the human CYP19(aromatase) gene in ovary and adipose tissue of transgenic mice[J].JSteroidBiochemMolBiol，2001(79)：193-201.

(編輯 程金華)

Cloning and Expression Assay of SheepCYPl9 Gene Ovarian Promoter

SUN Hong-xin1，2，ZHANG Ying-jie1*，LIU Yue-qin1，CHEN Xiao-yong2，DUN Wei-tao2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China； 2.HebeiInstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，Baoding071000，China)

The research was conducted to clone the sheepCYP19 gene ovarian promoter fragments and detect the tissue-specific expression in cells level.According to the known sequence the specific prmiers were designed，1.1 and 0.5 kb of sheepCYP19 gene ovarian promoter fragment were amplified by PCR，then the sequences were analyzed by software with published sequences.After eukaryotic expression vector pCYP19-1.1-EGFP-N2and pCYP19-0.5-EGFP-N2were constructed by cloning promoter fragments into the pEGFP-N2vector without CMV，then the recombinant plasmids were transfected into sheep granular cells and fetal fibroblast cells by liposome LipofectamineTMLTX+PLUS.The EGFP fluorescence expression was observed under the microscope after transfection for 24，48 and 72 h.The sequenced results showed that sheepCYP19 gene promoter fragments which were cloned were 1.1 and 0.5 kb length and had highly homologous with the published sequences.The sequence analyzing with transcription factor binding sites prediction software indicated that the promoter fragment contained a core promoter cis-element smilar with TATA box and transcription factor binding sites.24 h after transferring with pCYP19-1.1-EGFP-N2，the EGFP-expressing positive granulosa cells could be observed，48 h after transferring，the EGFP-expressing positive granulosa was increased，72 h after transfection the EGFP-expressing positive granulosa increased to the most.But after transfection the EGFP which was expressed in sheep fetal fibroblast cells was little.The results also showed that no EGFP-expressing positive granulosa cells and fetal fibroblast cells were observed at 24，48 and 72 h after transfection with pCYP19-0.5-EGFP-N2.The sheepCYP19 promoter 1.1 kb can drive foreign gene expressing in sheep granulosa cells and it can be used for the functional studies of fecundity-related genes and transgenic animal research，but it is not ovarian specific expression promoter.

sheep；CYP19；ovarian promoter；expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.008

2015-01-26

國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目(CARS-39)

孫洪新(1978-)，女，山東臨清人，高級畜牧師，博士生，主要從事羊遺傳繁育研究， E-mail：sdlqshx@126.com

*通信作者：張英杰，教授，博導，主要從事羊遺傳育種及營養(yǎng)研究，E-mail ：zhangyingjie66@126.com

S826.2

A

0366-6964(2015)09-1540-09