單永鋒,王彩蓮，姜藻，周守兵，鄭士亞

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

載阿霉素的磁性微泡雙模式的成像效果及其對(duì)淋巴瘤細(xì)胞毒性的研究

單永鋒1,王彩蓮2，姜藻2，周守兵1，鄭士亞1

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210009)

目的:探討多功能高分子微泡(MPMBs)雙模式成像效能及其聯(lián)合超聲對(duì)DLBCL彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞株SU-DHL-4增殖和凋亡的影響。方法:以機(jī)械振蕩法制備共載阿霉素及超順磁性氧化鐵的MPMBs，觀察其體外增強(qiáng)B超、磁共振顯影的能力；將SU-DHL-4細(xì)胞株按處理方法不同分組，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)雙染法觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果：MPMBs較普通高分子微泡(PMBs)具有更好的超聲、磁共振顯影效果；MPMBs聯(lián)合超聲對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖的抑制強(qiáng)于其他處理組。結(jié)論：MPMBs是一種可集治療與超聲、磁共振成像于一體的多功能造影劑。

微泡；氧化鐵；多柔比星；彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤

近年來(lái)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)發(fā)病率不斷升高，死亡率居高不下[1]，在美國(guó)其發(fā)病率位居所有腫瘤的第5位[2]。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見(jiàn)的NHL，約占30%～40%[3]。目前，DLBCL缺乏有效的、無(wú)創(chuàng)的診斷方法，以蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)往往伴隨一系列嚴(yán)重的毒副作用，尤其心臟毒性[4]。因此，DLBCL診斷及治療的難題亟待解決。本研究旨在制備一種載抗瘤藥物阿霉素的磁性納米微泡，其在淋巴瘤組織的富集既可用于增強(qiáng)磁共振成像，有望早期、特異地診斷淋巴瘤，又能在超聲作用下定點(diǎn)、實(shí)時(shí)釋放阿霉素進(jìn)行治療，為淋巴瘤診療一體化理念的建立做出初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

聚左旋乳酸(PLLA，Mw=5 000，Sigma公司)，聚乙烯醇(PVA，醇解度88%，Mw=20 000～30 000，百靈威公司)，鹽酸阿霉素(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司)，司盤80、吐溫、異丙醇皆為分析純(上海久億化學(xué)試劑有限公司)，油酸修飾的超順磁性Fe3O4納米顆粒(SPIO，東南大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，AO-EB雙染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 主要儀器

Turrax@T 18高速攪拌器(10 G分散頭，德國(guó)IKA公司)，Master Sizer2000粒徑分析儀(英國(guó) Malven公司)，高分辨透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本JEOL公司)，ULTRAPLUS掃描電子顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)，KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(Sigma公司)，7.0 T微磁共振(德國(guó)Bruker公司)，GE醫(yī)用超聲診斷儀(美國(guó)GE Healthcare公司)，酶標(biāo)儀(Tecan Infinite F50，瑞士Tecan公司)，熒光顯微鏡(IX51， 日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1MPMBs的制備 (1) 將0.5 g PLLA溶于10 ml氯仿，加入1.5 ml阿霉素溶液(含阿霉素5 mg)、適量SPIO及0.5 ml司盤80，超聲波清洗機(jī)聲振混勻后以IKA分散機(jī)攪拌5 min，得初級(jí)微泡溶液。(2) 將上述初級(jí)微泡溶液倒入50 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的PVA溶液中，加入0.5 ml吐溫，IKA分散機(jī)攪拌30 min，形成水包油包氣的復(fù)乳微泡溶液。(3) 將上述復(fù)乳微泡溶液轉(zhuǎn)移到50 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的異丙醇溶液中，室溫下攪拌2～3 h以完全揮散氯仿。(4) 上述溶液于4 800 r·min-1離心5 min，移去上清液，產(chǎn)物用超純水重新分散，重復(fù)3次，再于1 800 r·min-1離心5 min，重復(fù)3次，移去上清液，終產(chǎn)物分散到25 ml超純水中，4 ℃下密閉避光保存。

1.3.2MPMBs一般性質(zhì)的測(cè)定 取一定量的樣品分別行透射電鏡和掃描電鏡檢測(cè)，了解其形態(tài)結(jié)構(gòu)；Master Sizer2000粒徑分析儀測(cè)定微泡粒徑及分布范圍。

1.3.3MPMBs藥物包封率的檢測(cè) 配制阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，紫外分光分度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定不同濃度阿霉素(x)對(duì)應(yīng)的吸光值(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程；取一定量的樣品離心后移去上清液，加5%鹽酸乙醇溶液以破壞微泡，4 ℃下避光保存24 h后離心測(cè)上清液吸光值，代入回歸方程計(jì)算被測(cè)樣品攜載阿霉素的量。藥物包封率的計(jì)算公式如下:藥物包封率(%)=WMB/Wtot×100%，其中WMB為全部樣品中攜載阿霉素的量，Wtot為制備過(guò)程中加入阿霉素的總量。

1.3.4體外雙模式成像 (1) PMBs的制備。除了未加入SPIO及用等量的超純水替代阿霉素溶液之外，其他步驟同上。(2) 體外超聲成像。自制一個(gè)瓊脂糖凝膠模型，其內(nèi)平行分布3個(gè)直徑約1 cm、深約2 cm的孔洞，分別注入等體積的生理鹽水、PMBs溶液及MPMBs溶液，用10 L線陣探頭垂直緊貼模型底部，觀察三者的顯影情況(超聲參數(shù):機(jī)械指數(shù) 0.4，增益 90，深度 3.0 cm)。(3) 體外磁共振成像。以3只Eppendof管分別裝載2 ml的生理鹽水、PMBs溶液及MPMBs溶液，在7.0 T微磁共振系統(tǒng)下成像，掃描參數(shù):梯度回波序列T2*WI,矩陣256×256，成像野 4 cm×4 cm，回波12，激勵(lì)次數(shù)3，掃描時(shí)間14 min 24 s，通過(guò)儀器自帶軟件進(jìn)行圖像重建，測(cè)量平均T2*弛豫值。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)胞系與培養(yǎng) 將復(fù)蘇的SU-DHL-4細(xì)胞株(德國(guó)Dsmz公司)培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U·ml-1)中，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，適時(shí)更換培養(yǎng)液，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.4.2分組干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分為以下6組:對(duì)照組(A組)、單純超聲組(B組)、阿霉素組(C組)、阿霉素組+超聲組(D組)、MPMBs組(E組)、MPMBs+超聲組(F組)。調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105·ml-1，每組均取 3 ml細(xì)胞懸液在6孔板中各置1孔。A、B組加PBS 3 ml，C、D組加入阿霉素PBS溶液3 ml，阿霉素終濃度為0.1 μg·ml-1，E、F組加入含有MPMBs的PBS溶液3 ml，對(duì)應(yīng)的MPMBs濃度由阿霉素包封率計(jì)算而來(lái)，使其內(nèi)包載的阿霉素濃度亦為0.1 μg·ml-1。B組及D、F組在加入藥物或MPMBs 30 min后給予強(qiáng)度為1 W·cm-2的超聲連續(xù)作用120 s。

1.4.3細(xì)胞活力檢測(cè) 各組分別于干預(yù)后第24、48、72小時(shí)接種細(xì)胞懸液到96孔板，每組接種3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl，CCK-8法測(cè)定各孔吸光值。以如下公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力:細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組平均吸光值/空白對(duì)照組平均吸光值×100%。

1.4.4AO/EB雙染觀察細(xì)胞形態(tài) 各組分別于干預(yù)后第48小時(shí)各取1.5 ml，800 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加PBS 50 μl重懸細(xì)胞后加入2 μl的AO/EB染液，混勻后滴1滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡激發(fā)波長(zhǎng)510 nm下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MPMBs的一般性質(zhì)

見(jiàn)圖1。圖1a顯示透射電鏡下微泡呈圓形，膜殼載鐵率高；圖1b顯示掃描電鏡下微泡呈規(guī)則圓形，粒徑較均勻；圖1c說(shuō)明微泡粒徑主要分布區(qū)間為(603.3±190.8)nm。

圖1 MPMBs的透射電鏡照片×150 k(a)、掃描電鏡照片×13 k(b)和粒徑分布(c)

2.2 MPMBs的藥物包封率

阿霉素濃度-吸光值回歸方程為:y=0.020 88x+0.005 1，R2=0.991 8。經(jīng)計(jì)算阿霉素包封率為(25.41±4.52)%。

2.3 體外雙模式成像

見(jiàn)圖2、3。圖2顯示超聲聲像圖灰度MPMBs和PMBs明顯大于生理鹽水組，MPMBs略高于PMBs；圖3顯示磁共振信號(hào)MPMBs明顯低于PMBs和生理鹽水組，其平均T2*弛豫值分別為生理鹽水組為45.49，PMBs組為41.81，MPMBs組為18.65。

A.生理鹽水; b.PMBs; c.MPMBs

圖2 體外超聲成像圖

A.生理鹽水; b.PMBs; c.MPMBs

圖3 體外磁共振成像圖

2.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

見(jiàn)圖4。各組第24、48、72 小時(shí)的細(xì)胞活力，F(xiàn)組明顯低于其他各組，A組與B組、C組與D組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

圖4 作用于SU-DHL4細(xì)胞24、48、72 h后不同處理組細(xì)胞活力

2.5 AO/EB雙染熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察

顯微鏡下觀察顯示，C組與D組之間細(xì)胞形態(tài)差異不明顯，細(xì)胞密度較A、B組低，出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞；F組細(xì)胞密度最低，且多為凋亡細(xì)胞。

3 討 論

納米微泡不僅可用于超聲造影，而且是目前最受關(guān)注的非病毒性藥物載體[5]。王慶捷等[6]綜述了微泡傳輸藥物或基因的主要機(jī)制。

納米微泡具備被動(dòng)型和主動(dòng)型靶向作用。就靶向腫瘤組織而言，被動(dòng)型靶向[7]主要是指腫瘤組織血管的高通透性和不連續(xù)性可導(dǎo)致納米微泡滲漏到血管外，繼而被機(jī)體的免疫吞噬細(xì)胞吞噬而滯留；主動(dòng)靶向則主要是以腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的特異性抗原表位或受體作為靶點(diǎn)，或籍納米微泡的某種理化性質(zhì)(如對(duì)酸堿度、溫度、電荷或磁場(chǎng)等的敏感度)來(lái)實(shí)現(xiàn)。與其他腫瘤一樣，淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與血管生成密切相關(guān)[8-9]，而多種類型的淋巴瘤微環(huán)境中都有大量巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)[10-11]，這些都是微泡被動(dòng)集聚于瘤區(qū)的基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將SPIO裝載于微泡膜殼中，在外部磁場(chǎng)與被動(dòng)靶向的共同作用下微泡有望在腫瘤組織選擇性地更多地聚集，增強(qiáng)其與正常組織的信號(hào)對(duì)比。

空化效應(yīng)可增大細(xì)胞膜通透性，且可在細(xì)胞膜上產(chǎn)生大量可逆性的小孔，允許一定范圍分子質(zhì)量的物質(zhì)自由通過(guò)，這是細(xì)胞內(nèi)藥物濃度得以提高的主要機(jī)制[12-13]。本研究結(jié)果表明，對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增值的抑制，MPMBs聯(lián)合超聲較單藥阿霉素更高，細(xì)胞凋亡明顯增多，這可能與更多的阿霉素進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)。

本研究為DLBCL的雙模式成像及定點(diǎn)、實(shí)時(shí)治療作出了初步的探索，MPMBs對(duì)DLBCL活體腫瘤成像和治療的作用還有待進(jìn)一步研究。此外，為實(shí)現(xiàn)MPMBs在瘤區(qū)更多的集聚，我們?cè)O(shè)想針對(duì)DLBCL細(xì)胞CD20抗原的單克隆抗體可借助生物素-親和素系統(tǒng)偶聯(lián)于微泡膜殼之上，從而增強(qiáng)微泡主動(dòng)尋靶的能力。總之，DLBCL診療一體化的實(shí)現(xiàn)還有很多的工作要做。

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Doxorubicin loaded superparamagnetic microbubbles:dual-mode imaging and its cytotoxic effect on lymphoma cells

SHAN Yong-feng1，WANG Cai-lian2，JIANG Zao2，ZHOU Shou-bing1，ZHENG Shi-ya1

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To investigate the dual-mode imaging ability of multifunctional polymer microbubbles(MPMBs)， and to observe its effect on cell proliferation and apoptosis in SU-DHL-4 cells.Methods: The MPMBs were made by mechanical vibration method. Enhancement of ultrasound (US)/magnetic resonance(MR) imaging were evaluatedinvitro. The SU-DHL-4 cells were divided into several groups according to different treatments， then the viability of cells were measured by CCK-8 assay and the morphologic changes were detected by AO/EB staining.Results: US/MR dual-mode imaging showed its better property compared with ordinary polymer microbubbles(PMBs). Besides， anti-proliferation effect of MPMBs combined US on cells was much better than other treatment groups. Conclusion: The MPMBs can be served as a mutifunctional imaging agent for treatment and imaging.

microbubbles; iron oxide; doxorubicin; diffuse large B cell lymphoma

2015-01-11

2015-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(6590000065)

單永鋒(1982-)，男，江蘇鹽城人，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師。E-mail:syfeng1016@163.com

王彩蓮 E-mail:wangcailian65@hotmail.com；姜藻 E-mail:jiangzao@126.com

單永鋒，王彩蓮，姜藻，等.載阿霉素的磁性微泡雙模式的成像效果及其對(duì)淋巴瘤細(xì)胞毒性的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：365-368.

R313；R730.41；R733

A

1671-6264(2015)03-0365-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.007