超聲及超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的安全性研究*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科(西安710004)

潘龍飛 李麗君▲ 余 蕾△ 丁新愛 殷美靜

·論著·基礎(chǔ)研究·

超聲及超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的安全性研究*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科(西安710004)

潘龍飛 李麗君▲余 蕾△丁新愛 殷美靜

目的：探討超聲及超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的安全性。方法：將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別按超聲輻照時長及所加入的微泡劑量分組，超聲輻照后分別培養(yǎng)24h及48h,應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染法進行細(xì)胞計數(shù)，與對照組進行比較。超聲輻照含有不同微泡劑量的細(xì)胞后,行掃描電鏡觀察細(xì)胞膜形態(tài)。結(jié)果：不同輻照時長組經(jīng)超聲輻照后培養(yǎng)24h,10min、15min、30min組細(xì)胞計數(shù)比對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；繼續(xù)培養(yǎng)48h，各組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。不同微泡劑量組經(jīng)超聲輻照5min后培養(yǎng)24h,200μl、500μl組細(xì)胞計數(shù)比對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；繼續(xù)培養(yǎng)48h,500μl組細(xì)胞計數(shù)比對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。掃描電鏡可見超聲輻照后細(xì)胞膜完整性變差,繼續(xù)培養(yǎng)24h后有一定程度改善。結(jié)論：超聲輻照+微泡對細(xì)胞增殖有一定的抑制作用,對細(xì)胞膜有一定程度的損害,但這些作用在超聲輻照時長不超過5min及微泡劑量不超過100μl時是輕微、可逆的。超聲及超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是相對安全的。

近年來，基因治療成為醫(yī)學(xué)多個專科研究的熱點，如心血管領(lǐng)域研究的“分子搭橋”，可以采用的基因有多種[1]，卻沒有公認(rèn)的安全、高效的靶向轉(zhuǎn)染的方法。由于基因轉(zhuǎn)染的方法及載體決定了轉(zhuǎn)染的安全性及效率，因此圍繞該方向有較多的實驗研究。自1996年Unger等[2]首次利用超聲微泡造影劑(后文簡稱微泡)作為基因轉(zhuǎn)染的載體，并通過超聲輻照實現(xiàn)靶向基因轉(zhuǎn)染后，國內(nèi)外有多篇相關(guān)研究報告，作者也驗證了該方法的可行性[3]。雖然目前有較多采用該方法進行基因轉(zhuǎn)染的研究報告，但其安全性尚無定論，因此，作者設(shè)計該實驗，以探討在特定微泡存在的情況下，超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的安全性。

材料與方法

1 材 料 HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)：由西安交通大學(xué)藥理學(xué)教研室惠贈。CK30倒置顯微鏡：Olympus，日本。BX60顯微照相系統(tǒng)：Olympus，日本。Logiq 7全息彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)：GE，美國。DMEM培養(yǎng)基：Gibco，美國。SonoVue超聲微泡造影劑：Bracco，意大利。配置微泡：每瓶SonoVue (含SF659mg，凍干粉25mg)用5ml 注射用生理鹽水(9g/L NaCl)溶解，劇烈震蕩20s，至瓶內(nèi)藥物混合均勻。

2 HUVEC的準(zhǔn)備 選用對數(shù)生長期HUVEC，制備成單細(xì)胞懸液，按1×106/ml的密度，加100μl至無菌1.5ml離心管(Ep管)

3 超聲及超聲微泡造影劑對HUVEC增殖的影響 ①按照超聲輻照時長分為對照(無輻照)組、20s、1min、5min、10min、15min、30min組；每管加入100μl微泡。②按照加入的微泡劑量分為對照(無微泡)組、100μl、200μl、500μl組；參考上步驟實驗數(shù)據(jù)，選擇5min作為輻照時長。所有組均用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整體積至0.5ml。隨后,將Ep管置于37℃水浴,用7L線陣探頭(MI=1.5、f=8MHz、Depth=2cm)在距離Ep管2cm處按分組進行輻照；Ep管另一側(cè)置一橡膠塊吸收回波反射。隨后，細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h后，應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染法進行細(xì)胞計數(shù)。

4 超聲及超聲微泡對HUVEC細(xì)胞膜的影響 分為5組，每組3管。超聲輻照時長5min。A ：對照組(無微泡)；B：100μl微泡，輻照后即刻觀察；C：100μl微泡，輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h觀察；D：200μl微泡，輻照后即刻觀察；E：200μl微泡，輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h觀察。用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整體積至0.5ml。所有分組經(jīng)甩片、固定后，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

結(jié) 果

1 對HUVEC細(xì)胞增殖的影響 ①見表1，各組微泡劑量相同，超聲輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h，可見10min、15min、30min組細(xì)胞計數(shù)與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；繼續(xù)培養(yǎng)48h觀察，不同輻照時長組細(xì)胞計數(shù)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。說明：在微泡存在的情況下，超聲輻照對細(xì)胞增殖有一定抑制作用；這種作用是輕微的、可逆的；輻照時間不超過5min是相對安全的。②見表2，各組超聲輻照5min后繼續(xù)培養(yǎng)24h，可見200μl、500μl組細(xì)胞計數(shù)與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；繼續(xù)培養(yǎng)48h觀察，500μl組細(xì)胞計數(shù)與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。說明：隨微泡劑量增加，超聲輻照對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增加；這種作用是輕微的、可逆的；微泡劑量不超過100μl是相對安全的。

表1 各輻照時長組臺盼藍(lán)拒染法活細(xì)胞計數(shù)

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 各微泡劑量組臺盼藍(lán)拒染法活細(xì)胞計數(shù)

注：與對照組比較，*P<0.05

2 對HUVEC細(xì)胞膜影響 見附圖。B、C、D、E組較對照組(A)細(xì)胞膜完整性差，一部分細(xì)胞表面呈皺折狀突起，出現(xiàn)大小不等、數(shù)量不一、圓形或不規(guī)則形的小孔及裂隙，1～4μm左右，說明超聲+微泡可能對細(xì)胞膜造成損害，尤其高微泡劑量的D、E組(200μl微泡)明顯；繼續(xù)培養(yǎng)24h后(C、E)，分別與相應(yīng)輻照后即刻觀察組(B、D)相比，皺折狀突起、小孔及裂隙減少，說明超聲+微泡對細(xì)胞膜的損害是可逆的。如圖F箭頭所指小孔，可能為超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的途徑。

討 論

Y超聲輻照液體可以產(chǎn)生空化作用，即一定強度的超聲輻照所產(chǎn)生的交變壓可以形成微氣泡并導(dǎo)致其發(fā)生“爆破”，進而產(chǎn)生一系列的物理、化學(xué)效應(yīng)。液體中加入微泡造影劑，可以加強這種效應(yīng)。一定強度的超聲作用于微泡造影劑后，可使其“爆破”并產(chǎn)生微射流，進而在細(xì)胞膜上形成孔洞，促進攜帶的目的基因進入細(xì)胞；同時，超聲作用本身還可使細(xì)胞膜產(chǎn)生跨膜電流，導(dǎo)致細(xì)胞膜開放，進一步促使胞外的基因進入細(xì)胞。

1996年Unger等[2]利用上述原理，開創(chuàng)了利用超聲+微泡造影劑靶向傳輸藥物、基因的先河。1998年Richard等[4]利用超聲及Optison微泡向大鼠骨骼肌靶向傳輸標(biāo)記紅細(xì)胞及聚膠體取得成功。同年,Greenleaf等[5]利用超聲及Albuex蛋白微泡將綠色熒光蛋白基因(GFP)的質(zhì)粒，成功導(dǎo)入培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞內(nèi),證實轉(zhuǎn)染效率增加了3～4倍。2000年Lawrier等[6]報告超聲波輻射可使單純裸質(zhì)?；蛟谛难艿霓D(zhuǎn)染效率增加10倍,可使質(zhì)粒脂質(zhì)體法的轉(zhuǎn)染效率再增加3倍，如果使微氣泡與質(zhì)?；旌?，則比單純裸質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率增加300倍,如果使用的微泡是脂質(zhì)體微泡則基因轉(zhuǎn)染效率將比單純裸質(zhì)粒基因的轉(zhuǎn)染效率增加3000倍。2005年，Korpanty等[7]經(jīng)靜脈注射自制微泡,在超聲作用下將hVEGF165定向轉(zhuǎn)移到了大鼠心肌中，試驗結(jié)果表明治療組的心肌毛細(xì)血管和小動脈密度顯著增加。我們課題組也試驗證實應(yīng)用超聲輻照，可以將與SonoVue微泡充分孵育的GFP質(zhì)粒導(dǎo)入培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，未采用超聲輻照組未見表達(dá)[3]。

A ：對照組(無微泡)；B：100μl微泡，輻照后即刻觀察；C：100μl微泡,輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h觀察；D：200μl微泡,輻照后即刻觀察；E：200μl微泡,輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h觀察；F：圖B局部放大圖(30K倍)

盡管超聲+微泡促進基因轉(zhuǎn)染的可行性得到了驗證，但超聲+微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染時，如果強度過大，可能造成細(xì)胞的不可逆性損傷，即使成功轉(zhuǎn)染了基因，卻可能導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡[8-10]，失去了治療的價值。因此，我們設(shè)計實驗，選用90%直徑低于6pm且在國內(nèi)容易采購并普遍采用的SonoVue微泡，用超聲輻照后，行細(xì)胞計數(shù)并觀察細(xì)胞膜狀態(tài)，以探索超聲+微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的安全性。結(jié)果，實驗提示，超聲輻照+微泡對細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，對細(xì)胞膜有一定程度的損害，但這些作用在一定的超聲輻照時長及微泡劑量范圍內(nèi)是輕微、可逆的，超聲及超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是相對安全的。

然而，超聲在細(xì)胞懸浮液中與在組織或器官中產(chǎn)生的空化效應(yīng)是不同的。在體內(nèi)，細(xì)胞之間和細(xì)胞周圍的液體相對較少，超聲的空化作用會受到限制，且超聲在組織、器官中的衰減與體外環(huán)境也不相同，因此，將在動物實驗中進一步探討。

[1] 潘龍飛, 李麗君, 余 蕾. AKT對低氧模型細(xì)胞的促增殖作用[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2013, 42(13)：1441-1443, 1446.

[2] Unger EC, Hersh E, Vannan M,etal. Gene delivery using ultrasound contrast agents[J]. Echocardiography, 2001, 18(4)：355-361.

[3] 潘龍飛, 李麗君, 余 蕾. 超聲及超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的可行性研究[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2012,33(5)：661-663.

[4] Richard JP, Danny MS, Sanjiv K,etal. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound[J]. Circulation, 1998, 98：1264-1267.

[5] Greenleaf WJ, Bolander ME, Sarkar G,etal. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection[J]. Ultrasound in Med. & Biol,1998, 24(4):587-595.

[6] Lawrie A, Brisken AF, Francis SE,etal. Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery[J]. Gene Ther, 2000, 7(23)：2023-2027.

[7] Korpanty G, Chen S, Shohet RV,etal. Targeting of VEGF-mediated angiogenesis to rat myocardium using ultrasonic destruction of microbubbles[J]. Gene Therapy, 2005, 12(17)：1305-1312.

[8] Miller DL, Quddus J. Lysis and sonoporation of epidermoid and phagocytic monolayer cells by diagnostic ultrasound activation of contrast agent gas bodies[J]. Ultrasound Med Biol, 2001, 27(8)：1107-1113.

[9] Feril LB JR, Kondo T, Zhao QL,etal. Enhancement of ultrasound-induced apoptosis and cell lysis by echo-contrast agents[J]. Ultrasound Med Biol, 2003, 29(2):331-337.

[10] 趙麗榮, 王小叢, 楊松青, 等.診斷劑量超聲聯(lián)合超聲造影劑照射對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜影響的實驗研究[J].中國實驗診斷學(xué), 2007, 11(7)：949-951.

(收稿：2014-03-28)

Security of gene delivery mediated by ultrasound and microbubbles

Emergency Department, the Second Affiliated Hospital,of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Pan Longfei Li Lijun Yu Lei et al

Objective：To investigate the security of ultrasound-and microbubble-mediated gene delivery. Methods：24h or 48h after HUVEC, which was divided into different groups according to exposure time or microbubble does, was exposed to ultrasound, the number of living cells was counted by trypan blue exclusion assay, and comparison was made. Then, Observations were done by scanning electron microscopy. Results：After 24h-culture, compared with that in control group, cell count was decreased significantly in 10 min, 15 min and 30 min group (P<0.05), and after 48h-culture, there were no differences among the different exposure-time groups. 24h-culture after the cells in different microbubble-does groups were exposed to ultrasound for 5 min, compared with that in control group, cell count was decreased significantly in 200μl and 500μl group (P<0.05), and after 48h-culture, cell count was decreased significantly in 500μl group (P<0.05). Observed by scanning electron microscopy after exposure, we found that the integrity of the cell membrane became worse, and after 24h-culture, it could improve to some extent. Conclusion：Exposure by ultrasound with microbubble can inhibit the proliferation of cell and impaired the cell membrane to some extent. However, these functions are limited and reversible when the exposure time is no more than 5min and the microbubble does is no more than 100μl. Ultrasound- and microbubble-mediated gene delivery is relatively safe.

Microbubble Ultrasound Transgene Transfection

*國家自然科學(xué)基金資助項目(30370579)

▲通訊作者

△西安醫(yī)學(xué)院

微泡 超聲 轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)染

R331

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.001