樊維娜 孫經(jīng)武

陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院心血管介入科 (咸陽(yáng) 712000)

木犀草素預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響

樊維娜 孫經(jīng)武△

陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院心血管介入科 (咸陽(yáng) 712000)

目的：研究木犀草素預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。方法：以30只健康雄性Wistar 大鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)，缺血再灌注組(B組)，木犀草素組(C組)，每組10只，術(shù)前4d分別經(jīng)尾靜脈注射給予相應(yīng)處理。阻斷冠脈左前降支，構(gòu)建心肌缺血模型，缺血30min后再灌注2h。用ELISA法檢測(cè)大鼠血清 TNF-α,IL-6的含量，采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。結(jié)果：與A組相比，B組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、血清TNF-α及IL-6含量明顯上升(P<0.01)；與B組比較，C組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，血清IL-6和TNF-α的含量則顯著降低)(P<0.05或0.01)。結(jié)論：木犀草素預(yù)處理可以抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與減少促炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

缺血性心肌病是世界性的一個(gè)復(fù)雜的心臟疾病，它的主要的和最常見(jiàn)的原因是造成管腔狹窄或閉塞的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[1]，早期的再灌注治療是挽救瀕死組織的重要策略，但是再灌注本身也會(huì)對(duì)組織造成損傷，成為缺血再灌注損傷。其發(fā)生機(jī)制涉及活性氧的大量產(chǎn)生導(dǎo)致的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及染色體過(guò)氧化損傷，鈣離子超載，白細(xì)胞聚集，PH反常，ATP能量代謝障礙等。在這其中炎癥反應(yīng)液發(fā)揮了重要作用，體現(xiàn)在許多促炎因子如TNF-a，IL-6，IL-1β的釋放，對(duì)組織造成損傷，嚴(yán)重的可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及壞死，因此抑制炎癥反應(yīng)在一定程度上可以減輕心肌缺血再灌注損傷[2]。

木犀草素是一種可以在很多中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中提取到的黃酮類化合物，既往研究表明其具有多方面的的顯著的生物學(xué)效應(yīng)如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[3]。近年來(lái)關(guān)于其在缺血性疾病中的研究顯示其可以減輕腦缺血再灌注損傷[4]，也可以通過(guò)抗氧化作用進(jìn)行心臟保護(hù)。但是目前尚無(wú)大鼠心肌缺血再灌注炎癥反應(yīng)方面的研究報(bào)告。基于此種原因，我們借助大鼠模型，進(jìn)一步探索木犀草素在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，及該機(jī)制是否涉及炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。

1 資料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 以30只成年雄性Wister大鼠為研究模型，均重200±20g。

1.2 試 劑 木犀草素由陜西惠科植物開(kāi)發(fā)有限公司提供，使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na)制成0.4%的懸浮液。TUNEL試劑盒(南京凱基生物公司)，TNF-α及IL-6 的ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物公司)。

1.3 方 法 1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:將Wistar雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為如下3組：假手術(shù)組(A組)，缺血再灌注組(B組)，木犀草素組(C組)，每組10只。按如下方案給藥：假手術(shù)組(A組)：大鼠每日經(jīng)胃灌服0.5%CMC-Na1次，連續(xù)5d，劑量是10mL/(kg·d)，未經(jīng)缺血再灌注處理。 缺血再灌注組(B組)：大鼠每日經(jīng)胃灌服0.5%CMC-Na1次，連續(xù)5d，劑量是10mL/(kg·d)，5d后缺血30min，再灌注120min后取材。 木犀草素組(C組)：大鼠每日經(jīng)胃灌服0.5%木犀草素1次，50mg/(kg·d)灌胃,余操作同B組。

1.3.2 模型建立:用20%烏拉坦對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉(劑量9mL/kg)，連接并打開(kāi)Medlab，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖, 頸部切開(kāi)氣管，氣管插管行機(jī)械輔助通氣(通氣頻率60次/min，潮氣量20mL/kg)。在胸骨左緣0.4cm處開(kāi)胸并進(jìn)行肌肉分離操作后，切斷第4肋并將肋間肌分離，胸膜穿刺并分離心包膜, 擠出心臟。在左心耳下緣約4cm處進(jìn)針，于肺動(dòng)脈圓錐左緣出針，把一根聚乙烯管(直徑2mm)置于左前降支與結(jié)扎線間，用手拉緊結(jié)扎線促使聚乙烯管壓迫LAD造成冠脈血管急性閉塞，形成急性心肌缺血,在缺血30min后，取出聚乙烯管再灌注2h。觀察心電圖，以出現(xiàn)ST段顯著抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志，以缺血區(qū)心肌變紅、升高的ST段下降50%以上為再灌注成功的標(biāo)志。A組的大鼠手術(shù)過(guò)程與B組相同，但只在心肌下穿線不結(jié)扎左前降支。

1.3.3 測(cè)定IL-6、TNF-α含量：灌注120min后，穿刺抽血3mL(經(jīng)腹主動(dòng)脈)，執(zhí)行離心分離血清，參照TNF-α和IL-6試劑盒說(shuō)明書，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)：再灌注120min后剪下心臟，分離左室心肌，放置在多聚甲醛(4%)固定12 h后石蠟包埋。依照說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)：石蠟切片脫蠟去水，1% Triton X-100透明液促滲，3%H2O2封閉液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶；滴加反應(yīng)液；避光反應(yīng)及轉(zhuǎn)化；顯色；蘇木精復(fù)染；脫水透明；封片鏡檢。陰性步驟同上，只是不滴加TdT。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，凋亡細(xì)胞核顏色為深淺不一的棕褐色，心肌細(xì)胞核如正常則呈藍(lán)色，切片缺血部位隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400 倍)，統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，用單因素方差分析的方法進(jìn)行多組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 木犀草素對(duì)炎癥反應(yīng)的影響 如表1所示，與A組相比，B組及C組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的含量都明顯升高(P<0.01,P<0.05)；而與B組相比，C組TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量

注：與A組比較,△P<0.05, ▲P<0.01；與B組比較,◇P<0.05

2.2 木犀草素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響 如圖1及表2所示，TUNEL染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組及C組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.01)；與B組相比，C組凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌組織AI比較

注：與A組比較,△P<0.01;與B組比較,▲P<0.01

圖1 各組大鼠心肌組織TUNEL染色(×400)

3 討 論 心肌缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響著冠心病患者的臨床治療效果和預(yù)后，既往國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞聚集等，各種機(jī)制之間相互聯(lián)系，互為因果，最終導(dǎo)致心肌功能和結(jié)構(gòu)障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡與壞死。心肌細(xì)胞凋亡是其中最重要的原因之一。抑制心肌細(xì)胞凋亡可減少心肌缺血再灌注對(duì)心肌造成的損害。而木犀草素存在于許多中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中，Shuai Zhang[4]等的研究顯示，木犀草素對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制涉及抗氧化、抗凋亡、抗炎等方面。但目前國(guó)內(nèi)外研究尚未見(jiàn)有對(duì)其在大鼠心肌缺血再灌注炎癥反應(yīng)方面的研究報(bào)告。既往研究顯示炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用[5]，炎癥細(xì)胞的聚集和炎癥因子的釋放為關(guān)鍵步驟。在炎癥反應(yīng)中，許多細(xì)胞因子得以釋放，包括TNF-a、IL-6、IL-8等，而這其中，TNF-a是觸發(fā)心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的主要因子[6]，其是分子量為17kDa的可溶性多肽，由活化的巨噬細(xì)胞分泌，它可通過(guò)增加其他促炎細(xì)胞因子的釋放(如IL-6等)、增加細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，影響中性粒細(xì)胞的聚集,并最終引起急性心肌組織損傷。另外TNF-a也可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、參與血管重構(gòu)、抑制心肌收縮，對(duì)心肌缺血再灌注心肌造成損害。因此抑制TNF-a的表達(dá)，在一定程度上可以抑制心肌缺血再灌注的炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

在本研究中，我們可以發(fā)現(xiàn)，與A組比較，B組和C組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著增高；但與缺血組比較，藥物組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)則顯著降低，說(shuō)明木犀草素可以減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡損害。而與A組比較，B組的血清IL-6和TNF-α含量均明顯升高，說(shuō)明缺血再灌注可以激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)；較之B組，C組的血清IL-6和TNF-α含量顯著下降，說(shuō)明木犀草素可以抑制促炎因子TNF-α及IL-6的產(chǎn)生來(lái)減弱炎癥反應(yīng)，減輕其帶來(lái)的炎癥損害。因此，抑制炎癥反應(yīng)可能是木犀草素減少心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作心肌用的機(jī)制之一。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)木犀草素預(yù)處理可以抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與減少促炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[1] Mozaffari MS, Liu JY, Abebe W, et al. Mechanisms of load dependency of myocardial ischemia reperfusion injury[J]. Am J Cardiovasc Dis, 2013, 3:180-196.

[2] Wang C, Sun H, Song Y, et al. Pterostilbene attenuates inflammation in rat heart subjected to ischemia-reperfusion: role of TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(2):1737-1746.

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[6] 李健玲,陳兆霓,呂紀(jì)華. 玉郎傘皂苷對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(9):250-251.

(收稿2015-07-09；修回2015-08-02)

Effects of luteolin pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardium of ischemia-reperfusion injury in rats

Fan Weina Sun Jingwu

Department of Cardiovascular Interventional Division, Center Hospital in Xianyang City (Xianyang 712000)

Objective:To detective the effects of luteolin pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardium of ischemia-reperfusion(I/R) injury in rats. Method: Male wistar rats were randomly allocated into three groups: sham group (group A), I/R group (group B), luteolin group (Group C), with 10 rats in each group, 4 days before operation were injected via the tail vein giving corresponding treatment. The rats model of myocardial ischemia reperfusion (MI/R) injury was induced by a transient vessel occlusion for 30 min and reperfusion for 2h. The contents of, IL-6 and TNF- were detected by ELISA, and apoptosis index of myocardial cells was detected by TUNEL method. Resuls Compared to group A, group B， myocardial apoptosis index, serum TNF-α and IL-6 levels increased significantly (P<0.01).Results: Compared to group B, serum TNF-α and IL-6 levels and myocardial apoptosis index in group C were significantly lower (P<0.01 or 0.05). Conclusion: Luteolin pretreatment have protective effects on myocardial ischemia reperfusion injury in rats, the mechanism of it may be through down-regulated TNF-α and IL-10 expression to reduce inflammation and inhibit myocardium apoptosis.

Myocardial reperfusion injury/ traditional Chinese medicine therapy Resedaceae/therapeutic uses Animal experimentation Apoptosis

心肌再灌注損傷/中醫(yī)藥療法 木犀草科/治療應(yīng)用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞凋亡

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.050

△山東省濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院心內(nèi)科(煙臺(tái)264100)