付喜愛，張德顯，周 維，于立輝，田春蓮，劉明春

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

同源重組是指發(fā)生在姐妹染色體之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合，常用于基因敲除或者置換。目前，同源重組中以λRed同源重組系統(tǒng)在細(xì)菌中應(yīng)用最廣。Red同源重組系統(tǒng)是由λ噬菌體的exo、beta、gam 3個(gè)基因分別編碼的Exo、Beta（β）和 Gam（γ）蛋白組成。γ蛋白抑制內(nèi)源性RecBCD和SbcCD核酸酶作用［1］，從而保護(hù)導(dǎo)入的DNA鏈免于降解；Exo蛋白能從5′端到3′端降解雙鏈DNA（dsDNA）中一條鏈，留下全長(zhǎng)的一條單鏈 DNA（ssDNA）［2－3］；β蛋白與ssDNA結(jié)合并催化其退火，在復(fù)制叉出與新合成的鏈結(jié)合作為岡崎片段的一部分［2－3］，形成重組體。dsDNAλRed重組過程與寡核苷酸重組過程一樣［4］。Ellis H M 等［5］研究表明，λ噬菌體上的exo缺失對(duì)ssDNA重組的效率沒有影響，gam缺失重組率大約降低為原來的1／5，說明ssDNAλRed重組中只有beta是必不可少的。Mosberg J A等［2］研究支持全長(zhǎng)的ssDNA作為重組中間體，有助于闡明內(nèi)源性核酸酶如何作用于重組的ssDNA和dsDNA，為λRed重組機(jī)制提供了新的見解，對(duì)正確應(yīng)用重組技術(shù)就有指導(dǎo)意義。

λRed重組系統(tǒng)是大腸埃希菌靶基因置換的有效技術(shù)，為染色體DNA、質(zhì)粒或BAC上靶基因整合、刪除和點(diǎn)突變提供了簡(jiǎn)單而有效的方法［2］。利用λRed重組技術(shù)不僅可以構(gòu)建工程菌，還可以為研究細(xì)菌的致病機(jī)理和耐藥機(jī)制提供新的方法。據(jù)報(bào)道有許多因素可影響重組頻率，如底物濃度、同源片段的長(zhǎng)度、內(nèi)源性核酸酶、錯(cuò)配蛋白等［6－9］。論文綜述了λRed重組技術(shù)的研究進(jìn)展及影響重組的因素，以期為優(yōu)化重組試驗(yàn)方案及提高重組效率提供幫助。

1 λRed同源重組技術(shù)的應(yīng)用

λRed同源重組技術(shù)的原理是將一段攜帶與靶基因兩翼各有40bp～60bp同源序列的PCR產(chǎn)物或合成的寡核苷酸片段，通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞內(nèi)，在λ噬菌體編碼的Red重組酶的作用下，使導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的線性DNA片段與染色體或載體的特定靶序列進(jìn)行高效的同源重組，將靶基因置換下來。λRed同源重組系統(tǒng)是細(xì)菌基因敲除的有力技術(shù)，基因的缺失或置換是確定基因的未知功能、闡明致病機(jī)理的重要手段。利用λRed同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除在細(xì)菌中尤其是大腸埃希菌中的應(yīng)用最為廣泛。

1.1 構(gòu)建工程菌，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量

λRed同源重組系統(tǒng)在細(xì)菌中非常重要的應(yīng)用就是構(gòu)建工程菌。其主要目的是通過敲除細(xì)菌中的某個(gè)基因，改變細(xì)菌的代謝途徑，提高人類所需代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。趙志軍等［10］利用λRed同源重組技術(shù)在敲除大腸埃希菌的mtr基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建mtr.tnaB和mtr.aroP雙基因敲除菌，從而提高色氨酸的產(chǎn)量。陳欣等［11］利用λRed同源重組系統(tǒng)敲除一株可高效合成氨基葡萄糖GlcN和其乙?；苌颪－乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的重組大腸埃希菌Escherichiacoli－glms－gna1的nagE和 manX，獲得單基因敲除工程菌E.coli－glms－gna1－ΔnagE和nagE／manX雙基因敲除的工程菌E.coli－glmsgna1－ΔnagE－ΔmanX，這兩株工程菌GlcN的最大產(chǎn)量分別是對(duì)照菌株的1.08倍和1.20倍，GlcNAc的最大產(chǎn)量分別是對(duì)照菌的1.7倍和2.86倍，對(duì)GlcN的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。郭媛等［12］利用λRed同源重組技術(shù)敲除大腸埃希菌BW25113的pflB、frdAB、fnr、AdhE基因，成功構(gòu)建四基因敲除菌株，使得異丁醇的產(chǎn)量增加了40%。

眾所周知，L－色氨酸作為人和動(dòng)物的必需氨基酸，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)；氨基葡萄糖廣泛應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，氨基葡萄糖及其相關(guān)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)有巨大的開發(fā)空間和潛力；與乙醇相比，異丁醇具有物理性質(zhì)穩(wěn)定、運(yùn)輸方便、生產(chǎn)耗能較少的優(yōu)點(diǎn)，將來極有可能代替乙醇作為車用燃料。因此可以看出，利用λRed同源重組技術(shù)構(gòu)建工程菌，將會(huì)給人類和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1.2 探究細(xì)菌的致病機(jī)理

細(xì)菌致病的機(jī)理往往是多個(gè)因素相互作用的結(jié)果，很難確定某一因素對(duì)細(xì)菌致病性的影響程度。利用λRed同源重組技術(shù)敲除細(xì)菌中的某個(gè)基因，比較基因敲除前后菌株致病性的變化，從而有助于闡明致病機(jī)理。王海光等［13］利用λRed同源重組技術(shù)敲除大腸埃希菌O157∶H7的ompA基因，細(xì)胞試驗(yàn)表明外膜蛋白A基因敲除菌株的黏附力下降，對(duì)闡明大腸埃希菌O157∶H7的致病機(jī)制具有重要的意義。HPI毒力島是大腸埃希菌的重要毒力因子，其中irp2基因?yàn)殍F調(diào)節(jié)蛋白［14］，與細(xì)菌的致病性有密切的關(guān)系［15］。李葉芳等［16］利用λRed同源重組技術(shù)成功敲除禽致病性大腸埃希菌HPI毒力島irp2基因，為深入探究該基因在禽致病性大腸埃希菌治病過程中所發(fā)揮的作用打下基礎(chǔ)。余華等［17］利用λRed同源重組技術(shù)成功敲除銅綠假單胞菌的彈性蛋白酶基因Pa，將為系統(tǒng)深入的研究彈性蛋白酶在該菌致病性中的詳細(xì)作用機(jī)理提供材料和基礎(chǔ)。李保利［18］應(yīng)用λRed重組系統(tǒng)分別構(gòu)建腸炎沙門菌C50041crp、spiC單基因缺失菌株和雙基因缺失菌株，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明，這3株缺失菌與野生菌株相比對(duì)細(xì)胞的侵襲力明顯降低。由此可見λRed同源重組系統(tǒng)是探究細(xì)菌致病機(jī)理的一種重要方法，為致病機(jī)制的闡明做出突出的貢獻(xiàn)，同時(shí)也為弱毒疫苗的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1.3 研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制

隨著抗菌藥物的不合理使用，耐藥菌株的產(chǎn)生日益增加。對(duì)耐藥菌株的耐藥機(jī)制的研究已成為熱點(diǎn)。λRed同源重組技術(shù)為耐藥機(jī)制的研究提供了新的思路。Wu X等［19］利用λRed同源重組技術(shù)敲除大腸埃希菌的ompW基因，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示基因敲除菌株對(duì)硫酸新霉素和氨芐青霉素的敏感性大大提高，從而說明ompW基因在細(xì)菌抗性方面起著關(guān)鍵的作用。孟春萍［20］采用λRed同源重組技術(shù)成功構(gòu)建鴨大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株主動(dòng)外排基因acrB基因缺失菌株，敲除acrB基因后菌株對(duì)慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等5種藥物的敏感性較原菌株明顯升高，表明acrB基因在主動(dòng)外排中有重要作用。陳彩杰［21］應(yīng)用λRed同源重組技術(shù)成功構(gòu)建鴨大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株主動(dòng)外排調(diào)控基因marA基因缺失菌株，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示慶大霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星、多西環(huán)素對(duì)marA基因缺失菌株的MIC值較原菌株的顯著下降；并且通過熒光定量PCR方法檢測(cè)到marA基因缺失菌株的各主動(dòng)外排基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有所下降，表明marA基因?qū)喆竽c埃希菌多重耐藥具有一定的調(diào)節(jié)作用。由此可見，通過λ Red同源重組技術(shù)可以明確某基因在耐藥方面所起到的作用，有助于闡明耐藥機(jī)制，為新藥的合成提供理論平臺(tái)。

1.4 其他方面

何彰華等［22］利用λRed同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了一種四環(huán)素抗性表達(dá)載體pET－mt28a（＋），并可介導(dǎo)多基因的協(xié)同表達(dá)。牛小羽等［23］使用λRed同源重組技術(shù)構(gòu)建弗氏志賀菌2aphoN1基因缺失菌株，初步探究phoN1基因在該菌中的作用。Hu S B等［24］研究發(fā)現(xiàn)，λRed同源重組系統(tǒng)為研究根癌土壤桿菌基因功能組學(xué)和改良菌株提供了簡(jiǎn)便而快速的方法?？傊?，λRed同源重組技術(shù)推動(dòng)了細(xì)菌基因功能組學(xué)的研究。

2 影響λRed同源重組的因素

λRed同源重組的應(yīng)用往往因重組頻率而受到限制。研究人員發(fā)現(xiàn)，許多因素可影響重組頻率，如底物濃度、同源片段的長(zhǎng)度、內(nèi)源性核酸酶、錯(cuò)配蛋白等。深入了解影響同源重組的影響因素，對(duì)提高重組頻率，拓寬λRed同源重組技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。

2.1 底物和目的片段

細(xì)菌常以線性打靶片段dsDNA或ssDNA為底物進(jìn)行λRed同源重組。線性打靶片段的構(gòu)成相同，中間常為用于選擇的標(biāo)記基因片段，兩側(cè)為靶基因上下游的同源片段。

2.1.1 線性 DNA 的濃度 Yu D等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌中，只需要較低濃度（300ng）的線性dsDNA，λRed重組就能達(dá)到最大重組頻率；當(dāng)濃度繼續(xù)增加，甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出此濃度時(shí)，重組頻率不但不升高反而降低。而當(dāng)ssDNA的濃度相對(duì)較高（5μg）時(shí)，重組的頻率達(dá)到最大。

2.1.2 同源片段的長(zhǎng)度 在大腸埃希菌中，同源片段長(zhǎng)度為40bp的線性dsDNA能足夠有效的進(jìn)行λRed重組；當(dāng)同源片段長(zhǎng)度從40bp增加到1 000bp時(shí)，重組頻率只增加了10倍；而當(dāng)同源片段的長(zhǎng)度低于40bp時(shí)，重組頻率呈指數(shù)下降［6］。Mythili E等［25］研究表明，β蛋白能與36nt DNA鏈穩(wěn)定結(jié)合，不能與長(zhǎng)度小于36nt DNA鏈結(jié)合。同源片段的長(zhǎng)度可能影響其與互補(bǔ)片段的有效識(shí)別和配對(duì)。如果這個(gè)猜測(cè)成立的話，那么同源片段的長(zhǎng)度也影響β蛋白與同源片段分離，進(jìn)而影響著β蛋白釋放鏈的3′端和鏈的強(qiáng)配對(duì)。因此，如果同源片段太短，以至于不能與靶片段有效的配對(duì)，導(dǎo)致β蛋白仍然結(jié)合在鏈的3′端，就不能發(fā)生重組。

2.1.3 鏈偏差 Ellis H M 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ssDNA λRed重組中非模板鏈的重組頻率大約是其相應(yīng)模板鏈的5倍，這樣的鏈偏差在dsDNAλRed重組中不存在。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鏈偏差與DNA的復(fù)制方向相關(guān)。復(fù)制叉在原點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸，使得寡核苷酸更容易與后隨鏈的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行重組。DNA復(fù)制方向?qū)е骆溒钫f明ssDNA重組可能發(fā)生在復(fù)制叉附近。復(fù)制過程中ssDNA出現(xiàn)瞬態(tài)區(qū)域，與β蛋白結(jié)合催化其退火。后隨鏈重組頻率的增加可能反映了在以前導(dǎo)鏈為模板合成后隨鏈時(shí)，單鏈區(qū)域數(shù)量增加，DNA聚合酶和DNA連接酶完全可以將退火鏈連接到染色體上。雖然鏈偏差程度和重組體絕對(duì)數(shù)量有相當(dāng)大的差異，但是鏈偏差反映了染色體區(qū)域結(jié)構(gòu)和重組率的變化。Costantino N等［7］研究發(fā)現(xiàn)，去除MutS蛋白的菌株中仍存在鏈偏差現(xiàn)象，說明寡核苷酸序列和錯(cuò)配修復(fù)過程與鏈偏差不相關(guān)。在mutS基因敲除菌株中鏈偏差對(duì)重組頻率的影響表現(xiàn)的更加明顯［26］。

2.2 錯(cuò)配蛋白

細(xì)菌中許多蛋白參與復(fù)制叉的前進(jìn)。甲基導(dǎo)向錯(cuò)配修復(fù)（methyl－directed mismatch repair，MMR）系統(tǒng)能校對(duì)復(fù)制。MMR系統(tǒng)中的MutS蛋白結(jié)合DNA鏈與系統(tǒng)中其他的功能蛋白一起修復(fù)單一堿基對(duì)錯(cuò)配或者能清除1個(gè)～3個(gè)核苷酸的插入。宿主菌中的MMR系統(tǒng)能糾正復(fù)制出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，發(fā)現(xiàn)后立即切除錯(cuò)誤的堿基。ssDNA在DNA復(fù)制叉附近重組產(chǎn)生單堿基突變可能會(huì)觸發(fā)錯(cuò)配修復(fù)，因而影響重組的結(jié)果。相同條件下，缺失MutS蛋白的細(xì)菌λRed重組的頻率至少提高100倍，接近1／4的活細(xì)胞中出現(xiàn)堿基突變［7］。清除MutS蛋白的研究使得遺傳修飾更加有效，并且能允許核苷酸類似物和加合物與染色體結(jié)合進(jìn)行體內(nèi)生化研究。

2.3 內(nèi)源性核酸酶

盡管硫代磷酸（phosphorothioate，PT）鍵能阻礙λExo作用，但是5′端硫代磷酸化的dsDNA仍容易發(fā)生重組，這一謎團(tuán)直到 Mosberg J A等［8］研究首次確定ExoVⅡ（核酸外切酶）是降解ssDNA和dsDNA末端的核酸酶時(shí)才得以解。兩端硫代磷酸化的dsDNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌，ExoVⅡ降解一條或兩條鏈的5′端PT鍵產(chǎn)生與其結(jié)合的ssDNA末端。在ExoVⅡ作用后，λExo降解dsDNA的前導(dǎo)鏈，留下后隨鏈作為重組的中間體，完成這一步還需要解旋酶和其它內(nèi)源性核酸酶的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)dsDNA在不同核酸酶基因敲除菌株中的重組頻率各不相同［8］，說明內(nèi)源性核酸酶和重組基因之間密切相關(guān)，改變內(nèi)源性核酸酶的活性可能嚴(yán)重影響λRed重組，為進(jìn)一步提高dsDNA重組頻率提供了有價(jià)值的策略。

Dutra B E等［9］研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌中ssDNA核酸外切酶（ExoⅠ和ExoVⅡ）能抑制重組，在多個(gè)ssDNA核酸外切酶缺失菌株中，重組頻率顯著增高。清除ExoVⅡ不僅可提高重組頻率，同時(shí)還能提高ssDNA和dsDNA 3′末端突變的遺傳。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，清除一系列的5個(gè)核酸外切酶（RecJ、ExoⅠ、ExoVⅡ、ExoⅩ和λExo）可顯著提高λRed聯(lián)合選擇多元自動(dòng)化基因組工程（CoSMAGE）的操作，促進(jìn)重組多樣性的產(chǎn)生和更多的同時(shí)突變的形成［8］。Gregg C J等［27］研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用雙選標(biāo)記tolC能促進(jìn)CoS－MAGE的循環(huán)穩(wěn)定、持續(xù)，產(chǎn)生100%完全的基因置換，而不需要任何的間歇篩選或直接選擇。

2.4 其他因素

除了上述因素外，還存在其它的因素影響重組的效率，如λ噬菌體上pL啟動(dòng)子誘導(dǎo)時(shí)間。pL啟動(dòng)子由溫度敏感型λcⅠ阻遏因子控制，42℃時(shí)λcⅠ失活，誘導(dǎo)pL啟動(dòng)子表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為7.5min時(shí)，重組效率最大；誘導(dǎo)時(shí)間在7.5min～17.5min的范圍內(nèi)，能維持最大重組水平；當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)于17.5min時(shí)，重組水平降低，當(dāng)pL啟動(dòng)子的表達(dá)時(shí)間大于60min時(shí)，能導(dǎo)致細(xì)菌死亡［6］。另外，加入非特異性載體DNA能增強(qiáng)大腸埃希菌中λRed重組頻率［28］，這可能是因?yàn)檩d體妨礙內(nèi)源性核酸酶降解底物。但這種現(xiàn)象只在用于重組的寡核苷酸濃度較低時(shí)檢測(cè)到。敲除內(nèi)源性核酸酶基因的宿主菌，增加載體的數(shù)量不能使重組頻率增加。λRed重組中，非靶位點(diǎn)整合也影響重組頻率。Mosberg J A等［2］指出這可能是由于底物和基因組上非靶位點(diǎn)之間的微觀同源性導(dǎo)致錯(cuò)誤定位，但是影響錯(cuò)誤定位的因素還不確定。

3 小結(jié)

λRed同源重組系統(tǒng)是同源重組中發(fā)展最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的體內(nèi)遺傳工程研究技術(shù)，能任意的插入或刪除DNA片段而不用考慮限制性酶切位點(diǎn)的問題。但是在一些應(yīng)用中因重組頻率而受到限制。全面深入的了解影響λRed同源重組的因素，必將為細(xì)菌基因重組試驗(yàn)方案的優(yōu)化、改善重組工程的操作和深入研究重組機(jī)制提供理論依據(jù)。隨著研究的不斷深入，λRed重組技術(shù)必將應(yīng)用于更廣泛的細(xì)菌乃至生物體中，從而推動(dòng)功能基因組學(xué)的研究。

［1］Kulkarni S K，Stahl F W.Interaction between the sbcC gene ofEscherichiacoliand the gam gene of phage lambda［J］.Genetics，1989，123：249－253.

［2］Mosberg J A，Lajoie M J，Church G M.Lambda Red recombineering inEscherichiacolioccurs through a fully singlestranded intermediate［J］.Genetics，2010，186：791－799.

［3］Maresca M，Erler A，F(xiàn)u J，et al.Single－stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination［J］.BMC Mol Biol，2010，11：54－69.

［4］Court D L，Sawitzke J A，Thomason L G.Genetic engineering using homologous recombination［J］.Annu Rev Genet，2002，36：361－388.

［5］Ellis H M，Yu D，Ditizio T，et al.High efficiency mutagenesis，repair，and engineering of chromosomal DNA using singlestranded oligonucleotides［J］.Pro Natl Acad Sei USA，2000，2001，12（98）：6742－6746.

［6］Yu D，Ellis H M，Lee E C，et al.An efficient recombination system for chromosome engineering inEscherichiacoli［J］.Pro Natl Acad Sei USA，2000，11（97）：5978－5983.

［7］Costantino N，Court D L.Enhanced levels ofλRed－mediated recombinants in mismatch repair mutants［J］.Pro Natl Acad Sei USA，2003，26（100）：15748－15753.

［8］Mosbery J A，Gregg C J，Lajoie M J，et al.Improving lambda Red genome engineering in Escherichia coli via rational removal of endogenous nucleases［J］.PLoS One，2012，9（7）：1－12.

［9］Dutra B E，Sutera V A Jr，Lovett S T.RecA independent recombination is efficient but limited by exonucleases［J］.Pro Natl Acad Sei USA，2007，104（1）：216－221.

［10］趙志軍，陳 晟，吳 丹，等.大腸埃希菌色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除對(duì)色氨酸生產(chǎn)的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2011，27（12）：1765－1772.

［11］陳 欣，劉 龍，李江華，等.Red同源重組敲除nagE和manX對(duì)大腸埃希菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（3）：305－319.

［12］郭 媛，林麗華，龐 浩，等.大腸埃希菌astE、rph基因敲除突變株的構(gòu)建［J］.生物技術(shù)，2012，22（4）：21－25.

［13］王海光，顧 江，方 瑤，等.腸出血性大腸埃希菌0157∶H7外膜蛋白A敲除菌株的構(gòu)建及其黏附作用研究［J］.免疫雜志，2012，28（5）：420－423.

［14］盧 琴，嚴(yán)玉霖，高 洪，等.大腸埃希菌強(qiáng)毒力島治病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（4）：94－96.

［15］臧雅婷，嚴(yán)玉霖，高 洪，等.致病性大腸埃希菌HPI研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：153－156.

［16］李葉芳，涂 建，邵 穎，等.利用Red重組系統(tǒng)敲除APEC毒力島irp2基因［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，39（6）：146－150.

［17］余 華，熊浚智，何曉梅，等.采用Red重組系統(tǒng)敲除銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29（2）：129－137.

［18］李寶利.腸炎沙門氏菌C50041crp、spiC基因缺失菌株的構(gòu)建及其免疫生物學(xué)特性研究［D］.江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2013.

［19］Wu X，Zou H，Tian L，et al.Construction of ompW knock－out mutants ofEscherichiacolito increase sensitivity to neomycinsulphate and ampicillin［J］.Wei Sheng Wu Xue Bao，2012，52（8）：1021－1026.

［20］孟春萍.鴨大腸埃希菌acrB基因的缺失突變株構(gòu)建及其相關(guān)功能研究［D］.河南鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［21］陳彩杰.MarA基因?qū)喆竽c埃希菌多重耐藥的調(diào)控作用［D］.河南鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［22］何彰華，師明磊，王 洋，等.應(yīng)用Red重組技術(shù)構(gòu)建四環(huán)素抗性多基因串聯(lián)表達(dá)載體［J］.軍事醫(yī)學(xué)，2011，35（10）：754－757.

［23］牛小羽，胡 威，馮爾玲，等.弗氏志賀菌2aphoN1基因功能的初步研究［J］.軍事醫(yī)學(xué)，2014（1）：35－38.

［24］Hu S B，F(xiàn)u J，Huang F，et al.Genome engineering ofAgrobacteriumtumefaciensusing the lambda Red recombination system［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2014，98：2165－2172.

［25］Mythili E，Kumar K A，Muniyappa K.Characterization of the DNA－binding domain of beta protein，a component of phage red－pathway，by UV catalyzed cross－linking［J］.Gene，1996，182（1－2）：81－87.

［26］Swingle B，Markel E，Costantino N，et al.Oligonucleotide recombination in Gram－negative bacteria［J］.Mol Microbiol，2010，75（1）：138－148.

［27］Gregg C J，Lajoie M J，Mosberg J A，et al.Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering［J］.Nucleic Acids Res，2014，42（7）：4779－4790.

［28］Sawitzke J A，Costantino N，Li X T，et al.Probing cellular processes with oligo－mediated recombination and using the knowledge gained to optimize recombineering［J］.J Mol Biol，2011，407（1）：45－59.