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      “O”型口蹄疫正向間接血凝試驗的操作體會

      2015-03-23 12:20:55劉俊青山西省長治市郊區(qū)畜牧獸醫(yī)局046000
      當代畜禽養(yǎng)殖業(yè) 2015年2期
      關鍵詞:血球血凝稀釋液

      劉俊青 山西省長治市郊區(qū)畜牧獸醫(yī)局 046000

      正向間接血凝試驗是目前我國各地動物防疫監(jiān)督機構對口蹄疫進行免疫抗體水平檢測廣泛采用的試驗方法。該方法具有操作簡易、快捷、特異、既可定性又可定量等優(yōu)點,所需試驗設備簡單,具備一般條件的實驗室即能完成實驗操作。但是實驗結果受操作技術影響很大,保證實驗操作的細節(jié)是獲取正確結果的關鍵所在。

      1 原理

      抗原與其對應的抗體相遇時,在一定條件下會形成抗原抗體復合物,但這種復合物的分子團很小,肉眼看不見。若將抗原吸附在(致敏)經過特殊處理的紅細胞表面,只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應靈敏性。這種經過口蹄疫純化抗原致敏的紅細胞與口蹄疫抗體相遇,紅細胞便出現(xiàn)清晰可見的凝集現(xiàn)象。在間接血凝試驗中,紅細胞具有抗原載體和指示劑的雙重作用。

      2 實驗器材

      本實驗所使用的實驗器材包括微量血凝板、微量振蕩器和8 道移液器。為了保證實驗的順利進行,要選擇質量有保障、穩(wěn)定性好的器材。

      (1)微量血凝板。96 孔110°V 型醫(yī)用血凝板,此板可以疊放,但每次用完需要清洗。清洗方法:用過的血凝板應及時用高壓清水沖凈,再用5%的鹽酸浸泡48 小時,最后用蒸餾水或去離子水沖洗2次,甩干板子倒置于37℃溫箱中烘干備用。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈,如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點的孔,可用酒精棉簽擦凈。

      (2)微量振蕩器。使用振蕩器振蕩時間不宜超過1 分鐘,振蕩強度不能太大,多塊板疊加后振蕩時要用手壓住最上一板,以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實驗結果的準確性。

      (3)單、多道微量移液器。建議使用高質量的移液器,吸取液體時動作要輕緩,防止氣泡產生。移液器屬精密器械,用完后需用75%的酒精棉擦拭,并把刻度調到最大值。

      (4)吸嘴。吸嘴多為一次性消耗品。

      3 試劑

      (1)抗原。正向血凝抗原搖勻后呈棕紅色或咖啡色,無塊狀物沉淀,靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液體,搖勻后仍有小塊黑色沉淀物(血球團)的抗原,建議不要使用。1 瓶抗原可以檢測18~20 份血清。抗原2~8℃保存,保存期3 個月,切勿凍結。

      (2)對照血清。陰性對照血清呈淡黃色液體,陽性對照血清呈微紅或淡黃色稍渾濁液體。一般情況下2~8℃保存,保存期為3 個月。

      (3)稀釋液。稀釋液無色透明,低溫下放置,瓶底易析出少量結晶,在水浴中加溫后即可全溶。一般情況2~8℃保存,保存期3 個月。

      4 樣品血清

      待檢血清要保證新鮮、清亮透明,未檢血清在-20℃保存。同時避免血清反復凍融影響檢測結果。

      5 實驗過程

      正向血凝實驗過程包括:加稀釋液、稀釋待檢血清、稀釋陰陽性血清、加血凝抗原、震蕩靜置和結果判定。在試驗中要注意以下問題。

      (1)加稀釋液。在血凝板上1~7 排的1~10 孔、第8 排的1~4 孔和第5~7 孔,加稀釋液50μL/孔。

      (2)稀釋待檢血清。取待檢滅活血清樣品50μmL,分別加入反應板1~6 排的第1 孔中,于稀釋液混勻后吸取50μL 加入第2 孔,依次作2 倍系列稀釋至第10孔,第10 孔混勻后取出50μL 棄去。此時第1 排1~10孔待檢血清的稀釋度(稀釋倍數(shù))依次為1∶2、1∶4、1∶8……1∶256 和1∶1024。每個待檢血清樣品均按上述方法稀釋。在稀釋血清操作時避免產生過多氣泡,注意每取一份血清必須更換吸嘴。

      (3)稀釋陽性對照血清。在血凝板上的第7 排第1 孔加陽性血清50μL,2 倍系列稀釋至第10孔?;靹蚝髲脑摽兹〕?0μL 丟棄。此時陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為1∶2、1∶4、1∶8……1∶1024。

      (4)稀釋陰性對照血清。在血凝板上的第8 排第1 孔加陰性血清50μL,對倍稀釋至第4 孔?;靹蚝髲脑摽兹〕?0μL 丟棄。此時陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為1∶2、1∶4、1∶8 和1∶16。第5~7 孔為稀釋液對照孔,每孔僅加入50μL 稀釋液。

      (5)加血凝抗原。待檢血清各孔、陰陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原(充分搖勻,瓶底應無血球沉淀)25μL/孔。一次實驗過程應選擇同一批號的抗原,并先從稀釋度高的孔加起,避免滴頭和孔內的液體直接接觸。

      (6)振蕩混勻。將反應板置微型振蕩器上震蕩2~3 分鐘,然后在白色背景下觀察直至血球分布均勻,封板膜封板,室溫下靜置1.5~2 小時或將板置冰箱中冷藏延至次日判定結果。

      6 判定標準

      以呈現(xiàn)“++”血凝反應的血清最高稀釋度作為該血清的間接血凝抗體效價,血凝反應強度如下:“++++”紅細胞全部凝集,形成一層均勻膜,布滿整個孔底;“+++”紅細胞在孔底形成一層薄膜,面積比前者略?。弧?+”紅細胞在孔底形成薄膜凝集,邊緣松散或呈鋸齒狀;“+”紅細胞在孔底形成稀薄、散在的少量凝集,孔底有小圓點。

      7 值得探討的問題

      收到試劑盒應立即打開包裝,取出血凝抗原瓶,用力搖動,使粘附在瓶上的紅細胞搖下,否則易出現(xiàn)沉渣,影響使用效果;勿用90°和130°血凝板,嚴禁使用一次性血凝板,以免誤判結果;嚴重溶血或嚴重污染的血清樣品不易檢測,以免發(fā)生非特異性反應;抗原為懸浮液,每次滴加前應充分搖勻,并先從稀釋度高的孔開始加起,同時避免滴頭和孔內的液體直接接觸;當陽性血清抗體效價≥1∶256、陰性血清抗體效價≤1∶16、稀釋液對照孔無自凝現(xiàn)象時實驗成立;待檢血清使用前,需經過56℃水浴滅活30 分鐘;如果使用不同生產批號的紅細胞抗原復合物來檢測同一血清,應先測出這些血凝抗原的效價,然后將效價相同的抗原作為血液抗體檢測之用,這樣就可以保證結果的準確性,若血凝抗原效價差別較大,則可導致檢測結果出現(xiàn)誤差甚至錯誤。

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