劉艷環(huán)，李海濤，朱言柱，張潤(rùn)祥，肖佳美，苗利光

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

抗菌肽是生物體抵御病原微生物入侵而產(chǎn)生的一種多肽類物質(zhì)，是生物先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。在各種動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌中廣泛存在[2，3]?？咕牟粌H具有殺菌作用，還具有抗病毒、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[4～8]。目前，抗菌肽已成為藥理學(xué)、生理學(xué)等領(lǐng)域和醫(yī)藥食品、臨床等行業(yè)的研究熱點(diǎn)?？咕牡淖饔冒悬c(diǎn)決定其抗菌方式和強(qiáng)度，不同種抗菌肽對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制不同[9～13]。前期研究中我們研制出一種理化性質(zhì)穩(wěn)定、體內(nèi)外抗菌活性較強(qiáng)的抗菌多肽MSL抗菌肽(以下簡(jiǎn)稱MSL)[14，15]。本試驗(yàn)通過(guò)抗菌肽作用于細(xì)菌后檢測(cè)胞外蛋白質(zhì)濃度的變化和通過(guò)透射電鏡對(duì)細(xì)菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的觀察研究，明確該種抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷作用，為確定其作用靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗菌肽

MSL(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究室研制，純度>95%)。

1.2 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌(CVCC26003，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；綠膿桿菌(PAK/2pfs，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所疫病研究室保存)。

1.3 主要試劑及儀器

BCA蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；透射電子顯微鏡(H7650，Hitachi公司)；酶標(biāo)儀(VERSA max，MolecylarDevices公司)。

1.4 MSL作用于細(xì)菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)與分析

分別將綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液，5000r/min離心5min，棄上清，收集沉淀，用生理鹽水稀釋菌濃度至1×108個(gè)/mL，取制備好的菌液0.1mL至EP管中，加入MSL至終濃度為1×MIC，混勻，于37℃保溫孵育，分別于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min、240min離心收集上清液。用蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)蛋白濃度，分析蛋白濃度變化規(guī)律。

1.5 MSL作用于細(xì)菌的透射電鏡觀察

分別將金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD 0.6～0.8)，取菌液，5000r/min離心10min，棄上清，收集沉淀，用10mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)沖冼2次，用PBS調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1.5×108個(gè)/mL，將制備好的菌液取0.5mL至EP管中，然后加入純化的MSL至終濃度為1×MIC，混勻，于37℃保溫孵育60min，離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌菌體3次。將適量無(wú)菌水加入菌懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度至108個(gè)/mL。

取上述菌懸液與等量的2%磷鎢酸鈉水溶液在載玻片上混合染色30s。用無(wú)菌吸管吸取混合菌懸液滴在銅網(wǎng)膜上。經(jīng)2min～3min后，用濾紙吸去多余水分，待樣品干燥后，置低倍光學(xué)顯微鏡下檢查，選取菌體分布均勻的銅網(wǎng)作為觀察樣本，透射電鏡觀察分析樣本并記錄、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSL作用于細(xì)菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化規(guī)律與分析

利用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及綠膿桿菌和葡萄球菌樣品各時(shí)間點(diǎn)的OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品OD值及相應(yīng)濃度值做圖后，計(jì)算出樣品各時(shí)間點(diǎn)OD值對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度值。以蛋白質(zhì)濃度為Y軸、各時(shí)間點(diǎn)為X軸做圖，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 MSL作用于綠膿桿菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化

Fig.1TheconcentrationofextracellularproteinofpseudomonasaeruginosawithMSL

圖2 MSL作用于金黃色葡萄球菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化

Fig.2TheconcentrationofextracellularproteinofstaphylococcusaureuswithMSL

由圖可見(jiàn)，MSL與2種細(xì)菌接觸后可立即引起蛋白質(zhì)濃度提高，短時(shí)間內(nèi)又有所下降，反復(fù)幾次后蛋白質(zhì)濃度基本穩(wěn)定在明顯高于MSL未作用于菌體時(shí)的濃度值。可以確定，MSL可損傷細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，引發(fā)胞液外流，蛋白質(zhì)濃度升高。胞液中除各種蛋白質(zhì)外，還含有各種酶和其他物質(zhì)，造成蛋白質(zhì)部分被分解，引起蛋白質(zhì)濃度發(fā)生上述變化。

2.2 MSL作用于細(xì)菌后的透射電鏡觀察分析結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，MSL對(duì)綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的破壞作用，正常對(duì)照組的細(xì)菌菌體表面超微結(jié)構(gòu)致密均勻，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)電子密度較高且均勻，菌體周圍菌毛層結(jié)構(gòu)完整、清晰。MSL在1個(gè)MIC濃度作用60min后，細(xì)菌細(xì)胞壁遭破壞，細(xì)胞壁和胞漿內(nèi)電子密度降低，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜剝離，呈現(xiàn)不規(guī)則的圓形凸起，菌毛結(jié)構(gòu)混亂，有的脫落，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部不均勻，染色質(zhì)聚集，嚴(yán)重者細(xì)胞崩解結(jié)構(gòu)不清(圖3、圖4)。

a.正常綠膿桿菌細(xì)胞；b、c.MSL作用后的綠膿桿菌細(xì)胞

a.正常金黃色葡萄球菌細(xì)胞；b、c.MSL作用后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞

3 討論

抗菌肽因具有廣泛的生物學(xué)功能，特別是廣譜的抗菌功能而成為研究的熱點(diǎn)。目前，抗菌肽的抗菌機(jī)理仍然沒(méi)有研究清楚，原因是各種抗菌肽的抗菌方式不同。多數(shù)研究者認(rèn)為，抗菌肽主要是通過(guò)與細(xì)菌上的受體作用而發(fā)揮抗菌作用，如細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA或RNA、菌體的功能蛋白等，其中對(duì)細(xì)胞膜的作用研究最清楚[10～14]。

本研究選取革蘭氏陰性細(xì)菌綠膿桿菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌，研究MSL的作用靶點(diǎn)，分析該抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的作用及作用差異。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MSL對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌細(xì)胞膜均具有一定程度的破壞作用，并能作用于胞內(nèi)物質(zhì)引發(fā)染色質(zhì)聚集，對(duì)2種細(xì)菌損傷程度無(wú)明顯區(qū)別。

細(xì)菌細(xì)胞中存在多種蛋白酶，在細(xì)胞內(nèi)的分布有各自特定的區(qū)域，在細(xì)胞質(zhì)中含量最高，在細(xì)胞膜、周質(zhì)、外膜等也有分布。蛋白酶在細(xì)胞代謝中具有組成自身防御體系、降解無(wú)用蛋白質(zhì)等重要生理功能。本研究通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及被抗菌肽作用的綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌樣品各時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)濃度發(fā)現(xiàn)，MSL與細(xì)菌接觸后可立即引起蛋白質(zhì)濃度提高，短時(shí)間內(nèi)又有所下降，反復(fù)幾次后蛋白質(zhì)濃度基本穩(wěn)定在明顯高于MSL未作用于菌體時(shí)的濃度值?？梢源_定，MSL可損傷細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，引發(fā)胞液外流，同時(shí)，胞液中的蛋白酶造成蛋白質(zhì)部分被分解，引起蛋白質(zhì)濃度發(fā)生上述變化。上述研究證明，細(xì)菌細(xì)胞膜是MSL作用的主要靶點(diǎn)之一。

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