劉曉穎，馮二凱，吳洪超，馮卓，李光玉

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112)

細菌菌落計數(shù)是判別食品(或飼料)污染程度的指標，觀察細菌在食品(或飼料)中的繁殖動態(tài)，以便對被檢測樣品進行衛(wèi)生學評價[1，2]。在測定食品(或飼料)菌落總數(shù)實際工作中，常因檢測樣品中含有的微小顆粒沉渣與生長于瓊脂內(nèi)部的菌落難以區(qū)分、部分菌落細小或菌落顏色與瓊脂較相近，給菌落計數(shù)帶來一定的困難，進而造成實驗誤差。

2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)能夠被細菌還原成紅色物質(zhì)[3]，添加到培養(yǎng)基中可使菌落呈紅色，觀測和計數(shù)時可使菌落與樣品細小顆粒區(qū)分開，提高了檢測效率和準確度。但過量的TTC也會抑制細菌的生長，為此，培養(yǎng)基中適宜的TTC濃度是準確檢測細菌菌落數(shù)的重要前提。本試驗探討培養(yǎng)基中不同TTC濃度與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌生長數(shù)量的關(guān)系，研究TTC的安全用量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌(中國藥品生物制品中心)。

1.1.2試劑蛋白胨、牛肉膏(美國BD公司)；酵母浸出粉(英國OXOID公司)；氯化鈉、葡萄糖(分析純，北京化工廠)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(分析純，Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.11%TTC的配制稱取1g TTC，加入100mL蒸餾水，完全溶解后，用0.22μm濾膜除菌，于4℃冰箱中避光保存。

1.2.2菌液制備將-20℃保存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的液體培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置36±1℃培養(yǎng)24h，挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌典型菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，36±1℃培養(yǎng)24h。比濁法確定細菌濃度約為n×108CFU/mL，以上菌液依次作10倍稀釋，制備成濃度約為n×101CFU/mL的菌液。

1.2.3不同TTC濃度計數(shù)瓊脂的配制計數(shù)瓊脂按培養(yǎng)基配方稱取后，調(diào)pH，分裝后滅菌，待冷至56℃，分別加入無菌1% TTC溶液，使終濃度分別為0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，搖勻混勻，置于46℃水浴鍋中備用。

1.2.4細菌的倒入?yún)⒄諊覙藴蔊B4789.2-2010操作，用1mL滅菌吸管分別取上述細菌稀釋液于2組滅菌平板內(nèi)各1mL，將46℃水浴中含不同濃度TTC的計數(shù)瓊脂(包括不含TTC)注入平板內(nèi)約25mL，并轉(zhuǎn)動平板使混合均勻，同時分別將平板計數(shù)瓊脂25mL注入滅菌平板及加有1mL滅菌生理鹽水平板內(nèi)作空白和試劑對照，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌在不同TTC濃度的計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況

大腸埃希菌在不同TTC濃度試驗組中，TTC終濃度為0.002%時，菌落呈紅色，菌落大小與對照組相當；TTC終濃度≤0.01%時，菌落數(shù)量和對照組基本相當；TTC終濃度≥0.02%時，菌落呈黑色、點狀，菌落數(shù)量也明顯減少(表1)。

表1不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中大腸埃希菌生長檢測結(jié)果

Table1BacterialcolonymorphologyandnumberofEscherichiacoliindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0乳 白Milkywhite45460.0002乳 白Milkywhite54430.0004肉 色Incarnadine44470.0006肉 色Incarnadine35450.0008粉 紅Pink50430.001粉 紅Pink36460.002紅 色Red45420.004紅 色Red39380.006紅 色Red37420.008深紅色Oxbloodred4538

續(xù)表1

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0.01紫 黑Purpleblack41470.02黑 色Black21360.03黑 色Black100.04黑 色Black010.05/000.06/00

2.2 金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況

金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度試驗組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組相同，只是在TTC終濃度≤0.004%時，菌落數(shù)量和對照組基本相當；TTC終濃度≥0.006%時，菌落數(shù)量明顯減少；TTC終濃度≥0.02%時，幾乎無菌落出現(xiàn)(表2)。

表2不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長檢測結(jié)果

Table2BacterialcolonymorphologyandnumberofStaphylococcusaureusindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0乳 白Milkywhite47630.0002米 黃Riceyellow49380.0004肉 色Incarnadine50440.0006肉 色Incarnadine43390.0008粉 紅Pink35600.001粉 紅Pink44460.002紅 色Red4554

續(xù)表2

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0.004紅 色Red47460.006紅 色Red31280.008深 紅Oxbloodred19220.01紫 黑Purpleblack20180.02黑 色Black120.03黑 色Black120.04/000.05/000.06/00

2.3 鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況

鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度試驗組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組、金黃色葡萄球菌組變化基本相同。菌落數(shù)量在TTC終濃度≤0.01%時，和對照組基本相當；TTC終濃度≥0.02%時，菌落數(shù)量和對照組相比逐漸減少(表3)。

表3不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌生長檢測結(jié)果

Table3BacterialcolonymorphologyandnumberofSalmonellatyphimuriumindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0乳 白Milkywhite81850.0002乳 白Milkywhite77740.0004肉 色Incarnadine99730.0006肉 色Incarnadine6473

續(xù)表3

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0.0008粉 色Pink88720.001粉 紅Pink78740.002紅 色Red81770.004紅 色Red74670.006紅 色Red69750.008深 紅Oxbloodred77730.01紫 黑Purpleblack82660.02黑 色Black21360.03黑 色Black1070.04黑 色Black690.05黑 點Blackspot580.06黑 點Blackspot24

3 結(jié)論

3.1 在食品(或飼料)的加工、貯藏、運輸過程中被污染的細菌種類很多，包括致病菌、條件性致病菌和非致病性細菌，如埃希菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬等。歸納起來主要為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。本次試驗選取大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌為革蘭氏陰性菌代表，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌代表。

3.2 食品(或飼料)進行檢測時，一些殘渣微粒不可避免地被吸入，影響了細菌菌落總數(shù)的計數(shù)。添加一定濃度的TTC于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中，細菌在生長過程中能與其結(jié)合形成紅色，殘渣則保持原有的顏色，更有利于計數(shù)。TTC在使用時，應配制成溶液，4℃避光保存；TTC不耐高溫，易吸潮，所以不能直接加入到培養(yǎng)基中滅菌；TTC溶液向培養(yǎng)基中添加時，培養(yǎng)基的溫度也不宜過高，否則會使培養(yǎng)基變成紅褐色，導致TTC失效。TTC溶液加入56℃水浴保溫的培養(yǎng)基中，使TTC與培養(yǎng)基混合均勻并冷卻到46℃時，再與待檢樣品混合，鋪板，以免細菌被燙死。

3.3 使用適宜終濃度的TTC測定菌落總數(shù)時，由于菌落呈紅色，與培養(yǎng)基顏色差別明顯，與不含TTC的培養(yǎng)基計數(shù)相比計數(shù)方便、耗時短，提高了工作效率。賈杰[4]選0.2% TTC溶液于培養(yǎng)基中，采集飲用水、酒、醬油、消毒牛奶、棒冰共105份樣品，利用TTC-涂抹法進行試驗，結(jié)果TTC濃度為0.2%組結(jié)果優(yōu)于國家標準方法，但涂抹法的缺點是加入樣品量少，所造成的誤差較大；王曉文等[5]用浸泡濾紙法進行抑菌試驗，但紙片中TTC的量難以控制；楊慶文等[6]通過加入不同濃度的TTC得出添加0.2% TTC時為宜的結(jié)論，但TTC濃度的使用范圍較窄。本實驗選用平板灌注法對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌進行檢測，結(jié)果顯示，TTC終濃度在0.0008%～0.004%之間的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基最佳，在該濃度下能很好地使菌落顯色，同時又不會抑制細菌生長。

[1]GB4789.2-2010,食品微生物學檢驗[S].

[2]GB/T13093-2006,飼料中細菌總數(shù)的測定[S].

[3]郭炳才.應用TTC計數(shù)菌落的探討[J].中國公共衛(wèi)生,1999,5(4):30.

[4]賈杰.應用TTC-涂抹法測定食品中細菌總數(shù)[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2007,34(1):126-127.

[5]王曉文,張俊偉.TTC應用于食品菌落總數(shù)測定的研究[J].遼寧大學學報,2011,38(1):86-89.

[6]楊慶文,國譯丹,周惠新,等.不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂細菌生長試驗觀察[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(1):62-63.