賴(lài)婷婷，陳　樨，張如梅（福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，福建福州350014）

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豬流行性腹瀉病毒基因組研究進(jìn)展

賴(lài)婷婷，陳樨，張如梅
（福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，福建福州350014）

摘 要：豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為冠狀病毒屬（Coronavirus）不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，對(duì)仔豬具有較高的致死率。發(fā)病仔豬表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和脫水等臨床特征。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量的豬流行性腹瀉毒株基因組序列被測(cè)定，極大豐富了該病的分子流行病學(xué)信息。論文結(jié)合近年來(lái)關(guān)于豬流行性腹瀉基因組（尤其是主要抗原變異區(qū)S基因）結(jié)構(gòu)特征做一簡(jiǎn)要綜述，為豐富究豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)特征和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；基因組；S基因

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科（Coronavirinae）、α屬冠狀病毒（Alpha coronavirus）屬。α屬冠狀病毒屬有8個(gè)代表種，即α冠狀病毒1型（Alphacoronavirus 1）、人冠狀病毒229E（Human coronavirus 229E）、人冠狀病毒NL63（Human coronavirus NL63）、長(zhǎng)翼蝙蝠冠狀病毒1型（Miniopterus bat coronavirus 1）、長(zhǎng)翼蝙蝠冠狀病毒HKU8型（Miniopterus bat coronavirus HKU8）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）、菊頭蝙蝠冠狀病毒HKU2（Rhinolophus bat coronavirus HKU2）和黃蝠冠狀病毒512（Scotophilus bat coronavirus 512）［1-2］。

PEDV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其基因組大小約為28kb。其基因組5′-端有帽子結(jié)構(gòu)，3′-端有多聚A尾，其從5′→3′依次為5′-UTR（非編碼區(qū)，Untranslated region，UTR）-ORF1（replicase）-S （spike）-ORF3-E（envelop）-M（membrane）-N（nucleocapisd）-3′-UTR［3-5］。

1　5′-非編碼區(qū)和3′-非編碼區(qū)

豬流行性腹瀉病毒PEDV5′-UTR長(zhǎng)短不一，其長(zhǎng)度不同對(duì)病毒生物學(xué)特性的有無(wú)影響還未見(jiàn)報(bào)道明確。PEDV 5′-UTR核苷酸長(zhǎng)度在291bp～296bp之間，其內(nèi)部含有一個(gè)39bp（pos.99～137）小開(kāi)放閱讀框（ORF，open reading frame），編碼12個(gè)氨基酸的多肽（MFMLLEAGVEFH），在所有測(cè)定的冠狀病毒屬5′-UTR均存在這一特征。豬流行性腹瀉病毒PEDV3′-UTR位于病毒3′-端，在測(cè)定的PEDV基因組中，該處的長(zhǎng)度均為334bp，在其多聚A尾上游存在一個(gè)在所測(cè)定的冠狀病毒屬中均存在的八聚體序列（GGAAGAGC）。和PEDV5′-UTR基因存在核苷酸缺失和插入現(xiàn)象不同，但存在有核苷酸的點(diǎn)突變，其相關(guān)生物學(xué)功能還有待明確［6］。

2　ORF1基因

ORF1基因編碼病毒的復(fù)制酶（replicase），約占PEDV基因組全長(zhǎng)的2/3，包含2個(gè)主要的ORFs （ORF1a，ORF1b）。其中ORF1a長(zhǎng)短不盡相同，其核苷酸長(zhǎng)度在12 330bp～12 354bp之間，編碼452.82 ku（12 354bp）多聚蛋白1a（polyprotein 1a，PP1a）；ORF1b長(zhǎng)短在測(cè)定的序列中保持一致，核苷酸長(zhǎng)度均為8 037bp，編碼29.46ku多聚蛋白1b（polyprotein 1b，PP1b）。ORF1a編碼蛋白還含有3個(gè)轉(zhuǎn)膜域（TM）。ORFlb主要編碼RNA依賴(lài)性RNA聚合酶（RdRp），同時(shí)有3個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域分別是鋅指蛋白域（Zn）也稱(chēng)金屬結(jié)合域、螺旋酶域（Helix）和保守序列域（C）［6-7］。

ORF1a和ORF1b有46nt的重疊區(qū)，形成一個(gè)獨(dú)特的“假結(jié)（slippery）”結(jié)構(gòu)［8-9］，該特殊的結(jié)構(gòu)可引起核糖體在ORF1a/ORF1b連接處的7堿基滑序列（UUUAAAC）發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致該處病毒編碼區(qū)發(fā)生改變，形成一個(gè)由ORF1a和ORF1b共編碼多聚蛋白1ab（polyprotein 1ab，PP1ab），長(zhǎng)度約為753.08ku，對(duì)多聚蛋白切割產(chǎn)生具有功能產(chǎn)物的蛋白酶切割作用。

3　S基因

S基因編碼病毒的纖突蛋白（spike），該基因的啟動(dòng)密碼子通常并不是用于啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成，而是翻譯分子質(zhì)量為1 383個(gè)氨基酸編碼的多肽。S基因核苷酸長(zhǎng)短不一，其核苷酸長(zhǎng)度在4 143bp～4 161bp之間。目前，關(guān)于PEDV的S基因的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)研究較多，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，S基因可用來(lái)作為PEDV基因分型的一個(gè)依據(jù)，可將其分為2個(gè)大的基因群，G1基因群和G2基因群，各個(gè)亞群均可細(xì)分為2個(gè)小的遺傳分支，即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。研究還發(fā)現(xiàn)，G1基因群均存在有堿基缺失或插入現(xiàn)象（以基因插入為主）；而G2基因群則不同，其主要存在有堿基缺失（3bp或6bp）現(xiàn)象［10-11］。

氨基酸分析表明，G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸點(diǎn)突變外，又存在氨基酸插入和缺失現(xiàn)象；但G2基因群PEDV毒株卻不存在氨基酸插入現(xiàn)象，以氨基酸點(diǎn)突變?yōu)橹?。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列與CV777（G2基因群代表株）的同源性為93.0%～93.8%；G2基因群PEDV毒株氨基酸序列與CH/BJYQ/2011（G1基因群代表株）的同源性為95.2%～96.2%，而CH/BJYQ/2011與CV777的同源性最高為93.8%。由于PEDV只有一個(gè)血清型，氨基酸的變異并不會(huì)對(duì)血清型產(chǎn)生影響，但推測(cè)其和疫苗的推薦使用密切相關(guān)［12］。

對(duì)PEDV新流行株的S基因序列分析發(fā)現(xiàn)，PEDV流行株S基因已出現(xiàn)缺失（197aa）和插入（4aa），表明隨著疫苗的使用，PEDV基因組進(jìn)化趨勢(shì)增強(qiáng)［11］。以S基因繪制PEDV遺傳進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，PEDV可分為2個(gè)明顯的分支G1和G2，G1分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分離株，而G2分支均為新PEDV流行株，主要在韓國(guó)、美國(guó)等地流行［10］。

4　ORF3基因

ORF3編碼223或224個(gè)氨基酸多肽，是PEDV基因組編碼唯一的1個(gè)輔助蛋白，與冠狀病毒毒力強(qiáng)弱密切相關(guān)，其編碼的產(chǎn)物或許是一種未知的病毒包膜（envelope）蛋白，與病毒毒力有關(guān)［13］。通過(guò)比較ORF3全基因核苷酸序列可見(jiàn)，2株弱毒疫苗株CV777和DR13弱毒株均存在有連續(xù)核苷酸缺失，但缺失并不是完全相同的，為強(qiáng)、弱毒鑒別診斷方法的建立提供了依據(jù)。

由于ORF3中核苷酸缺失的存在，所以不能寄希望通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制ORF3產(chǎn)物。在ORF3序列中還發(fā)現(xiàn)2個(gè)功能基序（motif）：精氨酸酶信號(hào)肽和ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)，將其植入AKP基因，原核表達(dá)為異源二聚體融合蛋白［14］。

5　E基因

E基因全長(zhǎng)為231bp，編碼病毒囊膜上的小包膜蛋白，推測(cè)其在病毒的自我組裝和出芽過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。

6　M基因

M基因全長(zhǎng)為681bp，編碼226個(gè)氨基酸的跨膜蛋白。M蛋白可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性抗體（沒(méi)有病毒中和活性），能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，可作為PEDV基因工程疫苗的候選基因［15］。此外，不同基因群PEDV的M基因相互之間同源性較高，該基因常備要來(lái)作為PEDV診斷的候選靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，利用M蛋白制備單抗（MAb）能夠識(shí)別重組與天然M蛋白，可與Vero E6細(xì)胞感染的PEDV毒株產(chǎn)生特異熒光。

7　N基因

N基因全長(zhǎng)為1 326bp，編碼441個(gè)氨基酸的N蛋白。N蛋白是一種RNA結(jié)合蛋白，富含堿性氨基酸（如賴(lài)氨酸和精氨酸）殘基而表現(xiàn)出高度的堿性。N蛋白是冠狀病毒已知結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的磷酸化蛋白，絲氨酸殘基是潛在的磷酸化點(diǎn)。PEDV N蛋白磷酸化會(huì)病毒的二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，在堿性環(huán)境下會(huì)引入負(fù)電荷，會(huì)影響蛋白的RNA結(jié)合活性。PEDV N蛋白能在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中存在，說(shuō)明N蛋白中存在引導(dǎo)蛋白質(zhì)到細(xì)胞核定位的信號(hào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)N蛋白能與感染細(xì)胞中細(xì)胞核磷蛋白的共定位于細(xì)胞核細(xì)胞核磷蛋白（B23.1）［16-17］。

在感染PEDV的早期，動(dòng)物體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的較高水平的抗體，而且N蛋白的保守性高，利用N蛋白為基礎(chǔ)來(lái)建立PEDV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。研究表明，S蛋白備的S蛋白和N蛋白可用作ELISA抗原，分別建立S-ELISA 和N-ELISA，感染PEDV豬血清中的抗S蛋白抗體比抗N蛋白抗體更為持久［18-19］。

研究發(fā)現(xiàn)，不管接種PEDV滅活疫苗還是活疫苗對(duì)降低腹瀉率影響不大。通過(guò)更進(jìn)一步的S基因序列測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前豬群中的PEDV流行株（2011 年-2013年）和經(jīng)典疫苗株CV777之間核苷酸低于95%，但流行株之間的核苷酸同源性在97.8%以上［20］。結(jié)果表明，隨著CV777廣泛使用，導(dǎo)致PEDV流行株承受一定的抗壓選擇，已和疫苗株存在有較大變異，進(jìn)化成獨(dú)特分支［21-22］，提示在研發(fā)和使用PEDV疫苗應(yīng)轉(zhuǎn)變研究思路，并應(yīng)在疫苗使用時(shí)加強(qiáng)對(duì)PEDV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和對(duì)疫苗效果進(jìn)行有效評(píng)估。

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Progress on Genome of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

LAI Ting-ting，CHEN Xi，ZHANG Ru-mei
（Fuzhou Dabeinong Biotech Limited Company，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，350014，China）

Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）is an unsegmented，positive strand RNA virus，which can be cultured in Vero cells and cause high mortality in piglets.The disease is characterized by vomiting，diarrhea and dehydration.According to the progress on molecular biology and genome sequencing technology，especially the research for the spike gene，many PEDV viruses were sequenced，which make us know more clearly about the PEDV molecular epidemiology.This article summarized the research progress on the genomic structure and function proteins of PEDV，providing references for research and control to PEDV.

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；genome；spike gene

作者簡(jiǎn)介：賴(lài)婷婷（1985-），女，福建永安人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫病防治研究。

基金項(xiàng)目：福建科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013Y31010019）

收稿日期：2014-11-04

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）06-0119-03