喬春曉 何召慶/中國動物保健品有限公司

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流感疫苗生產用MDCK細胞懸浮培養(yǎng)技術研究進展

喬春曉 何召慶/中國動物保健品有限公司

傳統(tǒng)的流感病毒疫苗生產多采用雞胚培養(yǎng)工藝，這種方法一直沿用至今，然而這種生產工藝受到許多限制：雞胚來源受限；培養(yǎng)過程極易污染；成本不易降低；不能保證產品的質量穩(wěn)定性等。而在未來幾年，隨著對流行性和季節(jié)性流感疫苗的需求越來越大，人們會迫切選擇使用低成本質量高的疫苗，這也就使得以細胞培養(yǎng)技術生產流感疫苗成為趨勢，MDCK細胞就是適用于流感病毒疫苗生產的細胞系之一，其對流感病毒具有高度敏感性。故而研究MDCK細胞的大規(guī)模培養(yǎng)及制備病毒疫苗具有重大意義。其中，考慮到細胞本身的生長特性-貼壁生長，如果采用貼壁細胞培養(yǎng)應用于大規(guī)模工業(yè)生產會遇到很大的難題，如細胞的消化問題，因此，使MDCK細胞適應懸浮生長進而培養(yǎng)流感病毒就成為研究的重點。

一、MDCK細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術

細胞的懸浮培養(yǎng)可謂是理想的大規(guī)模細胞培養(yǎng)方式，懸浮培養(yǎng)技術是在生物反應器中，在人工條件下，高效率大規(guī)模的培養(yǎng)動物細胞進而應用于生物制品生產的技術，可根據(jù)細胞的貼壁能力分為微載體懸浮培養(yǎng)方式和全懸浮培養(yǎng)方式。

1.微載體懸浮培養(yǎng)。

MDCK細胞是從犬腎分離出來的一種貼壁依賴性上皮細胞，且它具有典型的“失巢凋亡”現(xiàn)象，即一種特殊的細胞程序死亡，是由于細胞與細胞外基質或相鄰細胞脫離接觸而誘發(fā)的，也就是說依靠傳統(tǒng)的馴化方式或者單純的用機械攪拌使MDCK細胞懸浮生長難度相當大。Van Wezel創(chuàng)立的微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)開創(chuàng)了細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)的先河，更為準確的說是使貼壁細胞大規(guī)模培養(yǎng)成為現(xiàn)實。微載體懸浮培養(yǎng)是一種先進的貼壁細胞培養(yǎng)技術，其原理是將對細胞無害的顆粒加入到生物反應器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞能在微載體表面附著生長，同時加以持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。反應器中使用微載體是一種可以提高細胞濃度的策略，其細胞密度可達1×107cells/ml。

采用微載體培養(yǎng)MDCK細胞，結合了懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，包括（1）細胞貼壁表面積大大增加，培養(yǎng)基利用充分，細胞密度增大。（2）微載體可在攪拌停止時沉降，便于將培養(yǎng)基與細胞分離。（3）與方瓶貼壁培養(yǎng)時的代謝變化不大，正常培養(yǎng)基可通用等等。

但是，目前生物反應器微載體培養(yǎng)研究只是單批次的培養(yǎng)，其消化放大培養(yǎng)依舊是難題。且微載體培養(yǎng)過程中一般添加了血清，給下游純化帶來了巨大壓力。采用商業(yè)無血清培養(yǎng)基，會大大增加企業(yè)生產成本。因此，自主開發(fā)無血清培養(yǎng)基進行MDCK細胞懸浮培養(yǎng)是目前的發(fā)展趨勢。

2.無血清單細胞懸浮培養(yǎng)。

我們知道，生物制品生產尤其是細胞培養(yǎng)方法生產病毒疫苗的過程十分嚴謹。細胞培養(yǎng)需添加血清，可是血清的加入無疑給生產后期的除雜純化等工藝帶來難度，而且，流感病毒血凝素HA可被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2，能夠介導病毒囊膜和靶細胞膜結合，病毒開始繁殖，而MDCK細胞本身不具備裂解HA的蛋白酶類，所以常常添加胰蛋白酶來提高病毒產量，但是，細胞培養(yǎng)中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，這種矛盾致使MDCK無血清培養(yǎng)問題更亟需解決。目前，MDCK無血清培養(yǎng)已經取得了很大的進展，基本思路是在基礎培養(yǎng)基的基礎上補加各種生物活性因子來替代血清，結合細胞生長所需成分，配制出無血清培養(yǎng)基，能夠支持MDCK細胞正常生長增殖。一般常見的營養(yǎng)添加因子有：胰島素，人轉鐵蛋白，氫化可的松等等，再經過對這些添加因子的添加量的優(yōu)化，最終確定無血清培養(yǎng)基成分。

現(xiàn)在，已有MDCK細胞商業(yè)用無血清培養(yǎng)基，它們的成功問世解決了這一大難題。通過直接法或間接法，即：原含血清培養(yǎng)貼壁細胞直接消化傳代換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)或逐步降低血清濃度直至降到無血清培養(yǎng)，使MDCK細胞適應無血清培養(yǎng)基，生長狀態(tài)優(yōu)良且能正常增殖傳代。

完成了MDCK無血清培養(yǎng)后，MDCK單細胞懸浮培養(yǎng)仍在研究當中，有文獻報道，已有馴化成功的MDCK懸浮細胞系，但就市場應用來看，是遠遠不夠成熟的?，F(xiàn)階段，馴化MDCK細胞在適應了無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎上，對其進行單細胞懸浮培養(yǎng)馴化方法主要有以下幾種：（1）使用硅化方瓶培養(yǎng)：將細胞培養(yǎng)方瓶先用硅化劑處理，防止了細胞的貼壁，再通過調整培養(yǎng)基成分，使細胞增殖；（2）使用搖床或搖瓶體系，通過外力作用，防止細胞貼壁，再對細胞進行篩選，然后擴大培養(yǎng)。

二、 MDCK細胞應用于流感病毒疫苗生產

采用細胞系培養(yǎng)流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生產方法，市場銷售的一些貼壁細胞系如Vero細胞，MDCK細胞是應用于流感疫苗研究最典型的哺乳動物細胞系，經研究，這些宿主細胞產生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，從相應的細胞培養(yǎng)生產的疫苗免疫應答效果和用雞胚生產的疫苗一樣好。MDCK細胞應用于流感疫苗生產有很多優(yōu)點：MDCK細胞易培養(yǎng)、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效擴增流感病毒；MDCK細胞生產的疫苗可以應用于對雞胚蛋白過敏的患者等等。在使用MDCK貼壁細胞接流感病毒后，通常會有較高的細胞特異性產率；微載體懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞，接流感病毒后，HA滴度可以高達9log2（1∶512）；就已知實驗室用馴化出MDCK懸浮細胞系接流感病毒，得出的TCID50值和HA滴度都高于貼壁細胞系。且已有疫苗廠商如Solvay制藥公司采用無血清培養(yǎng)基、微載體技術制備出了MDCK細胞流感亞單位疫苗；諾華公司制備出了由MDCK細胞培養(yǎng)生產的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在過去十幾年中，用動物細胞培養(yǎng)制備流感疫苗生產方式已經替代了傳統(tǒng)的使用雞胚生產方式。動物細胞培養(yǎng)生產流感疫苗的特征在于其靈活性和可擴展性，然而，貼壁細胞易培養(yǎng)但是卻很難擴大生產量，而如果使用微載體提供生長表面又會大大增加其成本。所以要努力創(chuàng)建懸浮細胞系，特別是MDCK懸浮細胞系。

多年以來，監(jiān)管部門督促行業(yè)設立無血清培養(yǎng)流程，以避免污染。然而，許多市售培養(yǎng)基仍然需要添加物，以達到高細胞密度和最大產物產量。理想的情況是，在疫苗生產中應該使用不需添加另外的蛋白質等混合物的已知成分的培養(yǎng)基。這不僅會降低批次變化的風險也有利于病毒收獲的下游處理。此外，疫苗生產過程可以被簡化，可以直接接毒而不用更換培養(yǎng)基。

各種傳代細胞系可用于工業(yè)生產，如PER.C6細胞，EB66細胞，AGE1.CR細胞等等，它們已經被應用于疫苗生產并且這些細胞系可以在不含動物血清的培養(yǎng)基中懸浮生長。還有一些懸浮生長的細胞如CHO細胞，BHK細胞，HEK293細胞也常常被用于重組蛋白，單克隆抗體和獸用疫苗的生產。所以懸浮MDCK細胞系是非常有必要且可行的，因為用這種細胞生產，其生產效率和經驗會增強生產過程中的穩(wěn)定性，并且十分經濟。MDCK細胞無血清全懸浮培養(yǎng)是最終目的，既可以解決血清帶來的種種不利，又可以避免使用微載體添加物帶來的未知隱患，從而可以提高細胞增殖效率且降低成本，保證產品的質量。正因如此， MDCK細胞無血清懸浮培養(yǎng)方法的研究更具有跨時代的意義。有報道說，有人用siat7e轉染MDCK細胞使其懸浮生長，并繁殖流感病毒，對MDCK細胞進行改性處理，無疑也是一種最直接的方法。但要真正實現(xiàn)簡單快捷的將MDCK貼壁細胞適應到懸浮培養(yǎng)，并進行大規(guī)模生產，還有很長的路要走。