基于“二維特征鑒別法”的巴西草藥GENGIBRE真?zhèn)舞b別

徐文英 馬愷悅 馮孟鑫 顧選 李妍芃 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

干姜為姜科植物Zingiber offcinale Rosc．的干燥根莖［1］，收載于2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)，在中國及巴西均是藥食兩用的常用藥材，具有溫中散寒，回陽通脈，溫肺化飲等功效，可用于脘腹冷痛，嘔吐泄瀉，肢冷脈微，寒飲喘咳。根據(jù)《葡漢詞典》［2］，巴西草藥GENGIBRE在葡萄牙語中意為姜，在國外作為調(diào)味品及辛香料被廣泛使用，與中國干姜的食用價(jià)值非常類似。為擴(kuò)大中國干姜的藥用資源，本文擬從基因鑒別與化學(xué)成分鑒別相結(jié)合的角度對巴西草藥GENGIBRE進(jìn)行真?zhèn)舞b別及品種鑒定。

DNA條形碼技術(shù)是目前中藥真?zhèn)舞b別及準(zhǔn)確物種鑒定可靠的技術(shù)和方法，本研究擬對以巴西草藥GENGIBRE的ITS序列進(jìn)行DNA測序，作為基因鑒別結(jié)果。此外，中藥干姜中所含 6-姜辣素(6-Gingerol)為其辛辣物質(zhì)，具有強(qiáng)心、降血壓、降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎止痛等廣泛的藥理作用，其含量直接影響干姜的品質(zhì)和藥效。因此，選用6-姜辣素為指標(biāo)對兩者進(jìn)行化學(xué)成分鑒別。通過巴西草藥GENGIBRE與中國干姜中6-姜辣素的含量差異，結(jié)合兩者的DNA條形碼匹配度結(jié)果，為巴西草藥GENGIBRE的品質(zhì)鑒定及擴(kuò)大中國干姜的藥用資源提供理論依據(jù)［3-11］。

1 材料與儀器

1．1 材料

藥材:巴西草藥GENGIBRE 3份(巴西隆城市場，樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室)、中國干姜(北京市花家地南里同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc．的干燥根莖)、6-姜辣素(中國藥品生物制品鑒定所，批號:111833-201102);試劑:乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)、甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)、娃哈哈純凈水、液氮。

1．2 儀器

植物DNA提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司，批號:69691125)、TProfessiona型PCR擴(kuò)增儀(德國 Biometra公司，批號:20092237)、ContigExpress軟件。

島津LC-20AT液相色譜儀(日本島津公司)、水浴鍋、粉碎機(jī)(型號:FW-100，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、電子天平sartorius AG BS110S(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、XBrige C18色譜柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm，美國 Waters公司)、FW400A高速萬能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

采用DNA條形碼技術(shù)和HPLC技術(shù)對巴西草藥GENGIBRE進(jìn)行真?zhèn)舞b別分析。即先根據(jù)樣品的遺傳信息確定其基源，結(jié)合指標(biāo)性成分的含量高低或存在與否，相互印證得出結(jié)論。

2．1 DNA條形碼分析

2．1．1 DNA提取 樣品經(jīng)乙醇消毒后，取每份樣品加液氮研磨成細(xì)粉，用博邁德DNA提取試劑盒提取，按照說明書提取總DNA，取5μL 1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

2．1．2 ITS序列的擴(kuò)增 采用擴(kuò)增ITS序列的通用引物，ITS上游引物 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3';ITS下游引物P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，50μL反應(yīng)體系中含模板2．5μL，Tap Mix酶25μL，引物 P1 2．5 μL，引物 P4 2．5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5分鐘;94℃變性50秒;55℃退火50秒;72℃延伸1分鐘;35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

2．1．3 測序 PCR產(chǎn)物在紫外燈下從1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行切膠，由上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序，以保證測序的準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物電泳在750 bp左右出現(xiàn)單一、清晰且明亮的條帶。3份樣品的測序峰圖良好，測序結(jié)果一致，截取ITS片段后選擇一條序列用于后續(xù)分析。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2．1．4 序列分析 利用contig1軟件對測序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接，根據(jù)BLAST所獲相似度最高物種的ITS序列邊界，截取待鑒定物種的ITS序列，對截取后待鑒定樣品的ITS序列進(jìn)行檢索，綜合考慮Score值、Coverage值、evalue值，初步確定相似度最高的物種為待鑒定樣品的基原。結(jié)果如圖2所示。圖2表明，樣品與蕓香科吳茱萸植物相似度最高，相似度范圍為97% ～99%，因此初步鑒定該樣品來自蕓香科吳茱萸Tetradium ruticarpum。

2．2 HPLC 法分析

2．2．1 對照品及供試品溶液的制備 對照品溶液制備:取 6-姜辣素對照品，精密稱定，配制成0.1014 mg/mL的對照品溶液，使用前0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

圖2 巴西樣品GENGIBRE的ITS序列BLAST結(jié)果

表1 中國干姜6-姜辣素的加樣回收率結(jié)果

圖3 對照品溶液及各供試品溶液的HPLC圖譜

供試品溶液制備:取各樣品粉末0．8 g(粉碎機(jī)粉碎，過80目篩)，置50 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確移取甲醇25 mL加入，準(zhǔn)確稱量，水浴加熱回流30分鐘，放冷至常溫，甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，續(xù)濾液0．45μm微孔濾膜過濾，即得。

2．2．2 色譜條件 色譜柱:XBrige C18色譜柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm，美國 Waters公司)，流動相:0 ～20 分鐘:乙腈 －水(45:55)，流速:1．0 mL/分鐘，進(jìn)樣量:10μL，柱溫:30℃，檢測波長:280 nm。

2．2．3 專屬性考察 按”2．2．1”項(xiàng)下方法制備對照品溶液及各供試品溶液，分別精密吸取對照品及各樣品供試溶液10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，各色譜圖見圖3。如圖所示，測定方法專屬性好，待測成分與其他成分分離度大于1．5，且其他成分對待測成分測定無干擾。

2．2．4 線性關(guān)系考察 精密吸取”2．2．1”項(xiàng)下對照品溶液 1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按”2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。線性方程為 Y=737357X －34852，R2為0．9999，結(jié)果表明6-姜辣素在0．1014～4．056μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．2．5 精密度考察 精密稱定中國干姜樣品0.8 g，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，RSD為0．45%，表明本法精密度良好。

2．2．6 穩(wěn)定性考察 精密稱定中國干姜樣品0．8 g，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)，按”2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，RSD為1．07%，表明本法穩(wěn)定性良好。

2．2．7 重現(xiàn)性考察 精密稱定中國干姜樣品0．8 g，一式 6 份，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，RSD為1．05%，表明本法重復(fù)性良好。

2．2．8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份中國干姜樣品，每份約0．4 g，精密稱定，分別精密加入一定量的6-姜辣素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率與RSD，6-姜辣素的平均回收率為103．5%，RSD為2．34%，表明本法含量測定結(jié)果良好。結(jié)果見表1。

2．3 6-姜辣素的含量測定結(jié)果

分別取巴西草藥GENGIBRE、中國干姜約0．8g，精密稱定，一式3份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按”2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算待測成分含量，巴西草藥、中國干姜中6-姜辣素含量分別為0．112%和0．759%。結(jié)果見表2。

表2 巴西草藥GENGIBRE、中國干姜中6-姜辣素的含量(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用“二維特征鑒別法”，對未知巴西草藥GENGIBRE進(jìn)行以中國干姜為標(biāo)準(zhǔn)的定向真?zhèn)舞b別。其一借助中藥DNA條形碼技術(shù)，對樣本進(jìn)行基原判別;其二利用HPLC技術(shù)對樣品與定向鑒別品種中指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定。最終將所得判別結(jié)果與含量測定結(jié)果進(jìn)行相互比對，綜合評判樣品真?zhèn)?。由DNA條形碼技術(shù)結(jié)果可知巴西草藥GENGIBRE與蕓香科植物吳茱萸相似度最高，相似度范圍在97%～99%，因此初步鑒定該樣品來自蕓香科吳茱萸Tetradium ruticarpum。由HPLC法測定干姜中活性成分6-姜辣素含量結(jié)果可知，兩者均含有6-姜辣素，含量分別為0．112%和0．761%。巴西樣品GENGIBRE中6-姜辣素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)0．60%，而中國干姜樣品品質(zhì)良好。綜合兩者結(jié)果可知，僅從化學(xué)成分角度進(jìn)行真?zhèn)舞b別易出現(xiàn)假陽性，而僅從基因角度鑒別無法得知樣品品質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用兩種方法結(jié)合比較，從而對未知樣品進(jìn)行“真?zhèn)蝺?yōu)劣”的全面鑒別。

另外，本實(shí)驗(yàn)對巴西藥草GENGIBRE中6-姜辣素含量測定時(shí)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，可能是由于吳茱萸的炮制方法中包含姜制法。因此，在進(jìn)行干姜的真?zhèn)舞b別時(shí)，若干姜樣品粉末中摻雜姜制吳茱萸粉末，則僅依據(jù)HPLC圖譜中6-姜辣素峰的有無無法判定未知樣品是否為干姜，還需要額外的判別指標(biāo)進(jìn)行印證。本文采用的“二維特征鑒別法”為中藥的質(zhì)量控制、資源普查、新品種選育等方面的研究提供了新的思路，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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