表達禽流感病毒H5亞型基因重組鴨瘟病毒的構(gòu)建

許夢微， 王志勝， 喬永峰， 顧一奇， 柳 暢， 侯繼波， 姜 平， 王繼春

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095)

鴨腸炎病毒(DEV)是引起鴨瘟(DP)或鴨腸炎(DVE)的病原，具有高致病性和傳染性，主要感染鴨、鵝和一些野生水禽，致死率高達100%［1］。DVE在美國和中國等許多國家都有報道［2］，2013年國際病毒分類學委員會報告中提到DEV，即鴨皰疹病毒1型，屬于皰疹病毒目、皰疹病毒家族甲型皰疹病毒亞科。DEV弱毒株和強毒株的全基因組已測通，其全長約158 kb，包含78個開放閱讀框［3］。

近年來已經(jīng)進行了一些關于皰疹病毒的細菌人工染色體(BAC)的研究［4-7］，應用BAC誘變技術可以構(gòu)建多種病毒突變體與載體疫苗，用以研究其病理學并開發(fā)其作為載體的潛能［8］。第一個DEV的BAC來自鴨瘟強毒株(V2085)，該毒株是從死亡的鴨體內(nèi)分離得到的。在BAC的基礎上，構(gòu)建了載有高致病性禽流感病毒H5N1 HA基因的DEV載體疫苗，能夠在感染細胞中高度表達HA蛋白質(zhì)［4］。

禽流感H5N1能夠感染人和動物，其極高的致死率以及高度突變的能力對于人類來說極具威脅，在世界范圍內(nèi)備受關注［9］。鳥類是禽流感病毒的主要宿主，而候鳥的遷徙則被認為是禽流感傳播與暴發(fā)的罪魁禍首［10］。鴨作為H5N1的主要攜帶者，對于雞和其他家禽來說是一個穩(wěn)定的傳染源［11］。因此，控制禽流感H5N1對鴨的感染是預防禽流感在禽類和人群中傳播的關鍵。

皰疹病毒的活病毒載體疫苗經(jīng)歷數(shù)十年的發(fā)展，已經(jīng)證實其能同時激發(fā)黏膜免疫和體液免疫［12-13］。迄今為止，一些皰疹病毒載體疫苗已經(jīng)獲得專利并在一些國家中廣泛應用［14-15］。除了DEV V2085株的早期研究，最近應用DEV全基因組的4種重疊DNAs在Fosmid系統(tǒng)中還構(gòu)建了另外一種以DEV疫苗株作為骨架的載體疫苗(rDEV-us78HA)［16-17］。本研究試圖將DEV疫苗株C-KCE感染性克隆，通過En Passant方法構(gòu)建了以BAC為基礎的DEV禽流感載體疫苗。該載體疫苗的構(gòu)建是將禽流感病毒H5N1株的保守序列HA通過人工合成后插入到DEVC-KCEBAC Sa克隆的UL55和LORF11之間的非編碼區(qū)，獲得表達HA的載體pDEVC-KCE-H5(UL55);再通過將帶有相同同源臂和gC基因的片段和pDEVC-KCE-H5(UL55)DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞進行重組，獲得重組毒DEV-H5(UL55)，為進一步開發(fā)應用DEV載體疫苗以及促進DEV病毒學的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與質(zhì)粒

DEV弱毒株DEVC-KCE，通過在SPF雞胚上連續(xù)傳代致弱，是廣泛應用的商品化疫苗株。所有的DEV病毒和突變體都在第一代或第二代CEF細胞上增殖，以感染復數(shù)(MOI)為0.01的劑量接種CEF從而構(gòu)建病毒庫。感染的細胞及其上清液經(jīng)過3次凍融(-70℃和37℃)以釋放病毒并保存在-70℃，通過病毒滴定的標準方法測定其在CEF細胞上的TCID50。BAC轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pDEVgc-pHA2由柏林自由大學的Niklaus Osterrieder教授惠贈。HA表達盒pDEV-H5(UL55)包括pMCMV IE啟動子以及修飾過的HA基因。HA基因是基于禽流感支系2.3.2.1的HA共有序列人工合成，并在裂解位點敲除了12個核苷酸系列。啟動子pMCMV IE來自于MCMV基因組第184336到182946位點的互補序列，并帶有Kozak序列。質(zhì)粒pDEV-H5 (UL55)KANin包含1個HA表達盒?？敲顾乜剐曰蛞约癝ac I酶切位點，可用于進一步的重組試驗。

1.2 細胞、病毒DNA的提取與轉(zhuǎn)染

CEF細胞的培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2，培養(yǎng)基為添加了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100 μg/ml鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基。pDEVC-KCE與pDEVC-KCE-H5(UL55)DNA通過SDS-蛋白酶K方法從感染細胞中萃取純化。本研究中通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染。具體來說，是向含有200 ng DNA水中加入62 μl 2 mol/L CaCl2，補水至總體積為500 μl后4℃過夜，然后再加入500 μl預冷的2×HBS溶液混勻即為轉(zhuǎn)染液。將每孔的原代CEF培養(yǎng)基更換為500 μl新鮮的不含胎牛血清及抗生素的DMEM，然后混入之前配好的轉(zhuǎn)染液37℃培養(yǎng)3～4 h后，倒掉培養(yǎng)基，并用PBS洗滌2次，在每孔中加入1.5 ml含有15%甘油的HBS溶液靜置2 min，最后再用PBS洗滌2次后，加入含有10%胎牛血清及抗生素的DMEM，置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 多步生長曲線的繪制

在CEF細胞上以MOI為0.01的劑量接種病毒，繪制其成長曲線。具體而言，在接種病毒后第0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h分別取樣測定上清液以及細胞凍融后的病毒滴度。在每個時間點取樣后將感染細胞用PBS洗滌2次并重懸于2 ml DMEM，反復凍融3次。500 g離心10 min后，取上清液，參照標準中TCID50方法測定其病毒滴度。在相同的時間點取細胞上清液離心后，測定上清液中的病毒滴度。試驗重復3次，繪制生長曲線。

1.4 細菌培養(yǎng)

電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.Coli DH10B購自Invitrogen公司。所用菌種GS1783由Nikolaus Osterrieder教授惠贈。電轉(zhuǎn)化方法參考文獻［18］。應用感受態(tài)細胞DH5α進行質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)化［4］。BAC及質(zhì)粒DNA的提取參照試劑盒說明書進行。

1.5 聚合酶鏈反應(PCR)、酶切分析及測序

設計了1對特異性引物［Kan ins′H5(HA)F和Kan ins′H5(HA)R］(表1)，在該引物的兩端各有1個Sac I酶切位點，PCR擴增后的卡那霉素抗性基因插入到質(zhì)粒pDEV-H5(UL55)中。另1對引物［DEV ins H5 casse UL55 F和 DEV ins H5 casse UL55 R］(表1)用于將HA表達盒插入到DEV BAC克隆中。為了拯救gC缺失病毒，設計了1對引物(DEV gC flanking F和DEV gC flanking R)(表1)用于PCR擴增含有gC基因并在其兩側(cè)各有一段同源序列的片段，長約1 000 bp。10對特異性測序引物(表1)用來驗證HA表達盒的正確插入，且BAC及其突變體經(jīng)EcoR I或BamH I酶切后進行限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)。

表1 聚合酶鏈反應(PCR)引物Table 1 Primers for PCR

1.6 DEVC-KCE感染性克隆的構(gòu)建

在DEV2085株BAC構(gòu)建方法的基礎上稍作改動，用于 DEVC-KCE感染性克隆的構(gòu)建［4］。首先，DEVC-KCE的DNA與pDEVgc-pHA2在原代CEF上共轉(zhuǎn)染，重組后mini-F基因替代了gC基因。在488 nm波長的熒光顯微鏡下觀察到綠色噬斑后，在CEF上進行3輪篩選以純化DEVC-KCE-mini-F。然后通過電轉(zhuǎn)化將DEVC-KCE-mini-F導入DH10B感受態(tài)細胞中，根據(jù)氯霉素抗性篩選陽性克隆，并進行RFLP分析。DEVC-KCE感染性克隆的DNA通過電轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌GS1783中，用于DEV基因組的進一步操作分析。

1.7 表達HA的重組載體DEV-H5(UL55)的構(gòu)建

基于DEV BAC克隆pDEVC-KCE，將HA表達盒插入到1個非編碼區(qū)。將先前公布的En Passant方法稍作修改，在DEV基因組的ORF UL55和LORF11之間從位點263至291替換核苷酸片段［19］。也就是以pDEV-H5(UL55)KANinDNA為模板，用引物(DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R)擴增兩端都帶40 bp同源序列的HA表達盒，再用Dpn I酶消化，除去可能的質(zhì)粒污染，將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至pDEVC-KCE感受態(tài)細胞進行第一次重組，然后進行第二次重組敲除卡那霉素抗性基因，獲得最終的重組HA載體克隆pDEVC-KCE-H5(UL55)。敲除卡那霉素后的選擇性克隆用EcoR I和BamH I酶切后進行RFLP進一步驗證。最終，通過與DEVC-KCEgCR相似的方法進行gC恢復，得到表達HA的載體DEVC-KCE稱作DEV-H5(UL55)。用引物(DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R)PCR擴增DEV-H5 (UL55)HA表達盒，然后連續(xù)用10對特異性引物(表1)進行測序來驗證HA的插入是否正確。

1.8 間接免疫熒光和Western blot分析

間接免疫熒光:DEV-H5(UL55)重組病毒F20代按50-100PFU比例在6孔板上接種雞胚成纖維細胞(CEF)原代細胞，在37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h，用固定液(96%乙醇/丙酮=3∶1)固定細胞，并在-20℃放置30 min。倒掉固定液，用PBS洗1次，吸出液體，加上PBS(0.1%Triton X-100)進行通透處理5 min。加入封閉液(PBS+3%BSA)過夜處理。加入抗AI(H5N1)HA單克隆抗體室溫包被1 h，用PBS洗3次，加入二抗羊抗鼠-Alexa488(1∶2 000)包被1 h。最終在488 nm紫外光激發(fā)下觀察。

Western blot分析:DEV-H5(UL55)病毒F5和F20代以MOI為0.01的劑量感染CEF細胞，感染后的細胞經(jīng)裂解液95℃ 10 min變性處理，經(jīng)SDSPAGE后將PAGE膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。與間接免疫熒光試驗來源相似的H5單克隆抗體作為一抗，1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG用作二抗。DEVC-KCE感染的細胞作為對照。

2 結(jié)果

2.1 帶mini-F基因的重組弱毒鴨瘟病毒的構(gòu)建

DEVC-KCE和pDEVgc-pHA2 DNA共轉(zhuǎn)染后3 d，產(chǎn)生帶有mini-F的重組質(zhì)粒DEVC-KCE，在488 nm波長的紫外線激發(fā)下觀察到綠色熒光。隨后，經(jīng)過三輪挑斑純化，獲得mini-F重組DEVC-KCE，稱作DEVC-KCE-mini-F。

2.2 DEVC-KCE感染性克隆的構(gòu)建

DEVC-KCE-mini-F DNA電轉(zhuǎn)入DH10B感受態(tài)細胞后，獲得數(shù)個帶有氯霉素抗性的克隆，我們選擇其中1個克隆，稱之為 pDEVC-KCE。pDEVC-KCE經(jīng)過BamH I和EcoR I酶切后進行RFLP分析，結(jié)果與預期有輕微的差別(圖1)，可能是DEVC-KCE與參考DEV (VAC)基因組序列相比有輕微地變異。將pDEVC-KCEDNA電轉(zhuǎn)入Escherichia coli GS1783電感受態(tài)細胞獲得感染性克隆Sa，并通過En Passant方法進一步構(gòu)建突變體。Sa經(jīng)BamH I和EcoR I酶消化后進行RFLP分析，圖像與pDEVC-KCE完全一樣。

2.3 pDEVC-KCE-H5(UL55)的構(gòu)建

依照En Passant規(guī)程，將帶有卡那霉素抗性基因的HA表達盒通過第一步重組插入到DEVC-KCEBAC Sa克隆，得到具有氯霉素和卡那霉素雙抗性的重組BAC克隆pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN。通過第二步重組將HA表達盒中的卡那霉素抗性基因敲除，獲得 DEV 重組 BAC，稱作 pDEVC-KCE-H5 (UL55)，其HA表達盒插入在UL55和LORF11間的無編碼區(qū)。RFLP分析結(jié)果顯示，用BamH I酶消化后，pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN出現(xiàn)3個條帶，大小約為10 000 bp、4 800 bp、2 700 bp，缺失 1條約13 000 bp的條帶(圖1A)，這些結(jié)果與預期條帶是一致的(圖1B)。EcoR I酶消化后，pDEVC-KCE-H5 (UL55)KAN出現(xiàn)1條約5 500 bp新條帶，取代了pDEVC-KCE-H5(UL55)約4 500 bp條帶(圖2A);與預期(圖2B)進行比較，電泳圖不完全一樣，可能是由DEVC-KCE和參考DEV基因序列之間的差異導致。

2.4 重組DEV的拯救及DEV-H5(UL55)的獲得

以DEVC-KCEDNA作為模板，DEV-HOMO1-for和DEV HOMO2-rev為引物 PCR擴增的片段，與pDEVC-KCEDNA進行共轉(zhuǎn)染，在488 nm波長的紫外線激發(fā)下觀察到白斑。經(jīng)過三輪挑斑純化，分離出純種毒。用引物DEV gC flanking F與DEV gC flanking R進行PCR擴增出約1 750～1 850 bp的目的條帶，序列分析顯示DEV病毒的gC基因完全恢復到親代病毒的相同位置。結(jié)果表明已獲得gC基因恢復毒，命名為DEVC-KCEgCR。

表達HA的載體pDEVC-KCE-H5(UL55)通過與DEVC-KCEgCR相似的方法進行 gC基因恢復，得到DEV-H5(UL55)。用引物DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R進行PCR擴增DEVC-KCE-H5 (UL55)HA表達盒，然后連續(xù)用10對特異性測序引物(表1)來驗證HA的正確插入。測序結(jié)果與預期完全一致，表明成功獲得了重組毒DEV-H5(UL55)。

圖1 pDEVC-KCE、pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN和pDEVC-KCE-H5(UL55)的限制性片段長度多態(tài)性圖Fig.1 Restriction fragment length polymorphism(RFLP)of pDEVC-KCE，pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN and pDEVC-KCE-H5(UL55)

2.5 重組毒DEV-H5(UL55)穩(wěn)定性與生長動力學

DEV-H5(UL55)在CEF上連續(xù)復制傳至F20代，以F20代DNA為模板，DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R為引物，擴增出約3 360～3 390 bp片段。測序結(jié)果顯示HA表達盒的序列與預期完全一樣，表明HA表達盒至少能穩(wěn)定表達20代。

通過3個獨立試驗，比較2種gC恢復毒DEVC-KCEgCR和 DEV-H5(UL55)與親代病毒DEVC-KCE的多步生長曲線。測定感染細胞上清液的滴度，感染12 h內(nèi)均檢測不出毒價，所有病毒株在感染細胞后72 h內(nèi)滴度約為0.1 ml 1×106TCID50。DEV-H5(UL55)與DEVC-KCE、DEVC-KCEgCR在感染48 h、72 h的毒價差異均不顯著(圖2A)。比較凍融3次后的細胞毒價，gC基因恢復毒 DEVC-KCEgCR和DEV-H5(UL55)比親代病毒DEVC-KCE效價稍低，但是DEV-H5(UL55)與 DEVC-KCE、DEVC-KCEgCR在感染48 h、72 h時毒價差異均不顯著(圖2B)。這些結(jié)果進一步證明DEVC-KCEBAC克隆是親代毒的完全克隆，UL55和LORF11非編碼區(qū)外源表達盒的插入不會影響病毒的增殖性能和穩(wěn)定性，體現(xiàn)了DEVH5(UL55)作為有前景的活載體候選疫苗的優(yōu)勢。

圖2 DEVC-KCEgCR、DEV-H5(UL55)與DEVC-KCE在CEF細胞上的多步生長動力學圖Fig.2 Multi-step growth kinetics of DEVC-KCEgCR，DEV-H5(UL55)and DEVC-KCEon CEFs

2.6 重組毒DEV-H5(UL55)HA的表達

間接免疫熒光試驗中，DEV-H5(UL55)F20代蝕斑能與單克隆抗體很好地反應，在488 nm紫外光激發(fā)下觀察到很強的信號，而對照DEVC-KCE蝕斑不顯示信號。蛋白質(zhì)免疫印跡分析，在感染 DEV-H5 (UL55)F5和F20代細胞裂解液中觀察到分子量約80 000的蛋白質(zhì)，而在感染DEVC-KCE的細胞裂解液中沒有此蛋白質(zhì)(圖3)。DEV-H5(UL55)F5和F20代檢測到的蛋白質(zhì)條帶大小要比最初合成的HA氨基酸序列(分子量約為68 000)要稍微大些。這種現(xiàn)象早期也出現(xiàn)在DEV v2085_H5的HA表達中，后被證實是由于HA蛋白質(zhì)的N-聯(lián)聚糖導致。表明依托DEV BAC構(gòu)建好的帶有HA表達盒的DEV-H5 (UL55)能夠有效穩(wěn)定地表達HA，且能穩(wěn)定表達至少20代以上。

圖3 DEV-H5(UL55)HA表達的蛋白質(zhì)免疫印跡分析Fig.3 Western blot analysis for HA expression of DEV-H5 (UL55)

3 討論

禽流感不僅對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失，而且威脅著人類的健康，所以，對其有效的防治具有重要的公共衛(wèi)生意義。此病難控制的主要原因有兩個:禽流感病毒的毒力在逐漸增強，新的致病型和毒力型在不斷出現(xiàn);至今沒有一種疫苗能真正有效地保護禽類免于禽流感病毒的感染。HA是構(gòu)成禽流感病毒囊膜纖突的主要蛋白質(zhì)之一，與病毒的變異、毒力和宿主特異性有關;同時，HA是病毒的主要保護性抗原，可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體，表達HA蛋白質(zhì)可刺激家禽產(chǎn)生對多種亞型禽流感病毒攻擊的保護能力，因此成為研發(fā)疫苗的主要研究對象［20-21］。

隨著DNA重組技術的發(fā)展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速發(fā)展，其中重組病毒活載體疫苗成為當前新型疫苗的研究熱點。與傳統(tǒng)疫苗相比，重組病毒活載體疫苗具有使用安全，免疫力持久等優(yōu)點，還可以達到一針預防多病的目的。應用皰疹病毒作為活病毒載體構(gòu)建表達外源基因的載體疫苗成為近些年來國內(nèi)外研究的熱點［22-23］。鴨腸炎病毒(DEV)是典型的皰疹病毒，其基因組有多個非必需基因和非編碼區(qū)，具有多個插入位點，應該能夠容許插入多個外源基因而不對自身的復制和生物學特性產(chǎn)生嚴重影響，是一個值得研究的重要病毒載體材料。研究發(fā)現(xiàn)，在很多皰疹病毒中，gC基因為非必需基因，主要作用是介導病毒的成熟和釋放，敲除這段基因雖然對病毒侵蝕力產(chǎn)生影響，但病毒仍能繁殖［24］。

本研究中，通過同源重組將BAC載體功能序列mini-F插入到DEV(atten)基因組中的gC區(qū)，成功構(gòu)建了DEV感染性克隆C-KCE。重組病毒采用GFP作為報告基因，轉(zhuǎn)染后24～48 h，在波長為488 nm紫外光激發(fā)下可以觀察到重組病毒形成的綠色蝕斑，與LacZ作為報告基因相比［25-26］，重組病毒篩選和蝕斑純化操作簡便。生長動力學和RFLP試驗結(jié)果表明該克隆包含了C-KCE株的整個基因組。在此感染性克隆基礎上，通過En Passant方法構(gòu)建了在UL55與LORF11開放閱讀框間插入HA表達盒的載體疫苗。運用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法將重組載體質(zhì)粒 pDEVC-KCE-H5(UL55)與 gC基因共同轉(zhuǎn)染CEF，經(jīng)過多次挑斑篩選和傳代，經(jīng)間接免疫熒光試驗和蛋白質(zhì)免疫印跡分析證實得到了表達禽流感HA基因的重組鴨瘟病毒，且能穩(wěn)定表達至少20代以上。重組毒DEV-H5(UL55)穩(wěn)定性與生長動力學研究結(jié)果表明UL55和LORF11非編碼區(qū)外源表達盒的插入不會影響病毒的增殖性能和穩(wěn)定性。

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