五星黃雞BMP15基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)性分析

凡文磊，劉紅舉，鄭麥青，劉冉冉，李慶賀，文 杰，趙桂蘋

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

五星黃雞BMP15基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)性分析

凡文磊，劉紅舉，鄭麥青，劉冉冉，李慶賀，文 杰，趙桂蘋*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

為研究五星黃雞骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，采用直接測(cè)序法檢測(cè)五星黃雞BMP15外顯子多態(tài)性。結(jié)果表明:五星黃雞在BMP15外顯子1和外顯子2中分別存在4個(gè)和9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中，外顯子1的C34T突變和外顯子2的T424C突變?yōu)殄e(cuò)義突變，分別導(dǎo)致亮氨酸變?yōu)楸奖彼岷透拾彼嶙優(yōu)榻z氨酸，其他均為同義突變;突變位點(diǎn)與300日齡產(chǎn)蛋量的關(guān)聯(lián)分析表明，H系C34T的TT基因型比CT基因型產(chǎn)蛋數(shù)多9.6枚(P＜0.05);而L系G540A的AA基因型產(chǎn)蛋數(shù)比GA基因型高16.7枚(P＜0.05)，其他位點(diǎn)在2個(gè)品系中與產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)性差異不顯著(P＞0.05);單倍型分析結(jié)果表明，H系BMP15基因不同單倍型組合與300日齡產(chǎn)蛋量的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，L系單倍型組合Block1中L4L4和Block3中L1L1產(chǎn)蛋數(shù)遠(yuǎn)高于其他單倍型組合(P＜0.05或P＜0.01)。本研究結(jié)果表明，BMP15基因多態(tài)性能顯著影響五星黃雞產(chǎn)蛋性能，上述多態(tài)位點(diǎn)和單倍型組合可能成為潛在的分子標(biāo)記用于雞產(chǎn)蛋性能的提高。

BMP15;單核苷酸多態(tài)性;五星黃雞;產(chǎn)蛋性能

產(chǎn)蛋性能作為影響肉種雞繁殖潛力和利用效率重要性狀,越來(lái)越多的受到重視。產(chǎn)蛋量是多基因控制的復(fù)雜形狀,具有較低遺傳力(0.12～0.42),并受環(huán)境、飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)等多重因素影響。應(yīng)用常規(guī)育種手段對(duì)此類性狀進(jìn)行選育,具有成本高、進(jìn)展慢等諸多缺陷。近年來(lái),分子標(biāo)記輔助選擇已成為加速低遺傳力性狀選育進(jìn)程的有效手段［1-2］。目前,已發(fā)現(xiàn)雞催乳素(PRL)及其受體(PRLR)等基因的多態(tài)性都與產(chǎn)蛋性能存在密切聯(lián)系［3-4］。

BMP15,亦稱生長(zhǎng)分化因子9B(growth/differentiation factor 9B,GDF9B),是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族的成員［5］。BMP15基因在多個(gè)物種間具有較高的保守性,均由2個(gè)外顯子和1個(gè)較長(zhǎng)的內(nèi)含子組成。BMP15在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá),通過(guò)影響卵泡發(fā)育和成熟來(lái)調(diào)節(jié)雌性哺乳動(dòng)物的繁殖性能［5-6］。敲除BMP15基因?qū)⒁鹦∈笊痴系K［7］。人BMP15基因704處發(fā)生A-G突變與卵巢發(fā)育不全導(dǎo)致的婦女高促性腺激素卵巢功能衰竭有關(guān)［8］。Galloway等［9］發(fā)現(xiàn),在Hamra綿羊和Inverdale綿羊中,BMP15基因FecX1突變?yōu)殡s合的綿羊排卵數(shù)上升,可以產(chǎn)2～3只羔羊,而BMP15突變?yōu)榧兒蠒?huì)導(dǎo)致原發(fā)性卵巢功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致繁殖力下降。目前,卵生動(dòng)物BMP15的研究仍然較少。

本實(shí)驗(yàn)以國(guó)家審定品種五星黃雞H系和L系母雞為研究對(duì)象,通過(guò)直接測(cè)序的方法檢測(cè)2個(gè)配套系群體中BMP15單核苷酸多態(tài)性,并將多態(tài)性位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,發(fā)掘與產(chǎn)蛋性能相關(guān)的分子標(biāo)記,為五星黃雞產(chǎn)蛋性能的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 五星黃雞配套系2011年獲得國(guó)家新品種證書,由三系配套(A系、H系、L系)。本研究以H系和L系母雞各300只為實(shí)驗(yàn)素材。所有參試母雞為同一批次,相同條件下飼養(yǎng),記錄并統(tǒng)計(jì)2個(gè)品系母雞300日齡產(chǎn)蛋數(shù),翅下靜脈采集血液約1 mL,阿氏液抗凝,-20℃凍存、備用。

1.2 基因組DNA提取 酚-氯仿法提取基因組DNA,TE溶解,核酸測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的原雞基因DNA序列(GenBank_NO∶NC_006091),用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)覆蓋外顯子1和2的引物3對(duì),引物由華大基因科技有限公司合成,引物信息見表1。

表 雞BMP15基因外顯子擴(kuò)增所用引物

表 雞BMP15基因外顯子擴(kuò)增所用引物

引物 引物(5′→3′) 產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp引物1 F:CGGGACCTCTTTCTGCTTTA 593 R:ACCAACATCTCCAAGCCAAG引物2 F:CTGGCACAGGAAATGGAAC 659 R:GATGATCCAATGGTCCCAAC引物3 F:TGAAGCTGAGCACCTTCTCC 833 R:GCATCGAGTGGAGACAAACC

PCR擴(kuò)增條件∶94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,60℃復(fù)性30s,72℃延伸45s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)和基因分型 為確定突變位點(diǎn)及突變類型,2個(gè)品系各隨機(jī)抽取15個(gè)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI3730測(cè)序儀測(cè)序進(jìn)行單個(gè)測(cè)序,而后用DNAstar和MegAlign軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,依據(jù)分析結(jié)果建立基因分型模式。最后根據(jù)建立的基因分型模式對(duì)剩余樣本測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Excel軟件分別計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率,并進(jìn)行卡方檢驗(yàn),判斷多態(tài)位點(diǎn)是否偏離Hardy-Weinberg平衡。利用Haploview 4.0、Phase 2.1軟件進(jìn)行單倍型分析。采用SAS(8.0)中的GLM程序?qū)蚨鄳B(tài)性及其單倍型組合與兩品系300日齡產(chǎn)蛋量分別進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。建立單因素方差分析模型如下∶

式中,Yijk為個(gè)體表型的記錄值;u為群體平均值;Gk為第k種基因型的固定效應(yīng),k=1,2,3;eijk為隨機(jī)誤差。

2 結(jié) 果

2.1 突變位點(diǎn)分析 2個(gè)品系共30個(gè)樣本PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果見圖1。外顯子1有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變,分別為C34T、A111G、C231T、C240T,其中C34T突變導(dǎo)致亮氨酸變?yōu)楸奖彼?其余突變均為同義突變。外顯子2有9個(gè)突變位點(diǎn),分別為C177T、A234G、C294T、C348T、T360C、T423C、G424A、G540A、C579T,其中G424A突變導(dǎo)致甘氨酸變?yōu)榻z氨酸,其余突變均為同義突變。

2.2 群體遺傳學(xué)分析 H系和L系有完整實(shí)驗(yàn)記錄的試驗(yàn)雞共495只(其中H系278只,L系217只),根據(jù)分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析了13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在2個(gè)品系中的基因型頻率、等位基因頻率,并對(duì)各多態(tài)位點(diǎn)基因型進(jìn)行了卡方檢驗(yàn)(表2和表3)。結(jié)果顯示,外顯子1的4個(gè)突變位點(diǎn)在2個(gè)群體中均極顯著偏離哈代-溫伯格平衡(＜0.01),而外顯子2的9個(gè)突變位點(diǎn)均符合哈代-溫伯格平衡(＞0.05)。此外,13個(gè)突變位點(diǎn)中,C348T和T423C突變型等位基因頻率明顯高于野生型,且L系中T423C突變位點(diǎn)未檢測(cè)到野生型純合子。

2.3 單倍型及單倍型頻率分析 利用Haploview 4.0和Phase 2.1軟件對(duì)13個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)H系有2個(gè)單倍型模塊,其中Block1包含C1839050T、C1839059T和C1839983T3個(gè)突變位點(diǎn), Block2包含A1840040G和C1840100T 2個(gè)突變位點(diǎn);L系有3個(gè)單倍型模塊,前兩個(gè)與H系相同,Block3包含G1840246A和C1840385T 2個(gè)突變位點(diǎn)(如圖2和圖3)。H系和L系共495只試驗(yàn)雞構(gòu)建的3個(gè)單倍型模塊中,H系Block1中發(fā)現(xiàn)了5種單倍型、10種單倍型組合,Block2中發(fā)現(xiàn)了4種單倍型、7種單倍型組合;L系Block1中發(fā)現(xiàn)了4種單倍型、8種單倍型組合,Block2中發(fā)現(xiàn)了4種單倍型、6種單倍型組合,Block3中發(fā)現(xiàn)了3種單倍型、6種單倍型組合。各單倍型及單倍型頻率見表4和表5。

2.4 單個(gè)突變位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)分析 對(duì)五星黃雞H、L系各突變位點(diǎn)不同基因型分別與300日齡產(chǎn)蛋數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,H系C34T突變TT基因型比CT基因型產(chǎn)蛋數(shù)多9.6枚(＜0.05),其余位點(diǎn)不同基因型個(gè)體之間產(chǎn)蛋數(shù)差異不顯著。L系外顯子2中突變位點(diǎn)G540A中AA基因型產(chǎn)蛋數(shù)比GA基因型高16.7枚(＜0.05),其余位點(diǎn)不同基因型個(gè)體產(chǎn)蛋數(shù)無(wú)顯著差異(見表6,僅列出了差異顯著位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果)。

圖 BMP15基因突變位點(diǎn)測(cè)序圖

表 H系BMP15基因多態(tài)位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析

表 H系BMP15基因多態(tài)位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析

注∶顯著水平χ20.05=5.99,χ20.01=9.21。下表同

位點(diǎn) 基因型頻率(個(gè)體數(shù)) CC/AA CT/AG TT/GG C(A) T(G) C34T 0.7806(217) 0.1007(28) 0.1187(33) 0.8309 0.1691 114.4110 A111G 0.6835(190) 0.1978(55) 0.1187(33) 0.7824 0.2176 48.8101 C231T 0.8094(225) 0.1259(35) 0.0647(18) 0.8723 0.1277 52.5749 C240T 0.8237(229) 0.0755(21) 0.1007(28) 0.8615 0.1385 129.8480 C176T 0.4892(136) 0.4209(117) 0.0899(25) 0.6996 0.3004 0.0005 A233G 0.4676(130) 0.4245(118) 0.1079(30) 0.6799 0.3201 0.1725 C293T 0.5216(145) 0.3921(109) 0.0863(24) 0.7176 0.2824 0.2945 C347T 0.1043(29) 0.4461(124) 0.4496(125) 0.3273 0.6727 0.0460 T359C 0.5468(152) 0.3885(108) 0.0647(18) 0.7410 0.2590 0.0409 T423C 0.7878(219) 0.205(59) 0.0072(2) 0.8903 0.1097 0.8538 G424A 0.0971(27) 0.4964(138) 0.4065(113) 0.3453 0.6547 2.6629 G540A 0.0072(2) 0.1403(39) 0.8525(237) 0.0773 0.9227 0.0803 C579T 0.3022(84) 0.5216(145) 0.1762(49) 0.5629 0.4371 0.9997等位基因頻率 χ2

表 L系BMP15基因多態(tài)位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析

表 L系BMP15基因多態(tài)位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析

位點(diǎn) 基因型頻率(個(gè)體數(shù)) CC/AA CT/AG TT/GG C(A) T(G) C34T 0.8203(178) 0.0783(17) 0.1014(22) 0.8594 0.1406 99.0861 A111G 0.7005(152) 0.1751(38) 0.1244(27) 0.7880 0.2120 49.1351 C231T 0.8249(179) 0.0875(19) 0.0875(19) 0.8687 0.1313 82.4138 C240T 0.7189(156) 0.1429(31) 0.1382(30) 0.7903 0.2097 70.2467 C177T 0.5853(127) 0.341(74) 0.0737(16) 0.7558 0.2442 1.2625 A234G 0.318(69) 0.4931(107) 0.1889(41) 0.5645 0.4355 0.0018 C294T 0.3917(85) 0.4424(96) 0.1659(36) 0.6129 0.3871 0.9937 C348T 0.0138(3) 0.3687(80) 0.6175(134) 0.1982 0.8018 5.5634 T360C 0.0737(16) 0.2995(65) 0.6267(136) 0.2235 0.7765 4.0740 G424A 0.1198(26) 0.3733(81) 0.5069(110) 0.3065 0.6935 3.2232 T423C 0.9078(197) 0.0922(20) 0.9539 0.0461 0.5064 G540A 0.0323(7) 0.235(51) 0.7327(159) 0.1498 0.8502 1.2924 C579T 0.318(69) 0.5299(115) 0.1521(33) 0.5829 0.4171 1.7540等位基因頻率 χ2

圖2 H系單倍型模塊圖

圖3 L系單倍型模塊圖

2.5 不同單倍型組合與產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)分析 H系 2個(gè)單倍型模塊中不同的單倍型組合300日齡產(chǎn)蛋數(shù)差異不顯著。L系Block 1中單倍型組合L4L4產(chǎn)蛋數(shù)高于L1L1、L1L2、L1L3、L1L4、L2L2、L2L3、L3L3組合(＜0.05);Block 3中L1L1組合產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于L1L2、L1L3、L2L2組合(＜0.05),Block2中各單倍型組合產(chǎn)蛋數(shù)差異均不顯著(見表7,相關(guān)性不顯著的單倍型模塊未在表中列出)。

表4 H系單倍型及單倍型頻率

3 討 論

表5 L系單倍型及單倍型頻率

表6 BMP15基因各突變位點(diǎn)不同基因型與300日齡產(chǎn)蛋數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

表7 L系單倍型組合與300日齡產(chǎn)蛋數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

3.4 單倍型組合與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系單倍型相關(guān)性分析 haplotype association analysis與單標(biāo)記分析相比,具有統(tǒng)計(jì)效率高、可進(jìn)行大范圍染色體區(qū)段分析而且檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì)［13］,并且單倍型和性狀間的關(guān)聯(lián)分析可以彌補(bǔ)單個(gè)SNP與性狀關(guān)聯(lián)分析中存在的不足。本研究中,H系單倍型組合之間產(chǎn)蛋數(shù)無(wú)顯著差異;L系Block1中L4L4單倍型組合產(chǎn)蛋數(shù)比L1L4組合多22.7枚,Block3中L1L1單倍型組合產(chǎn)蛋數(shù)比L1L2組合多18.7枚,差異均極顯著;2個(gè)品系不同單倍型組合間產(chǎn)蛋數(shù)差異不同,可能是由于2個(gè)品系血緣較遠(yuǎn)引起的。另外,有些位點(diǎn)本身與產(chǎn)蛋數(shù)沒(méi)有顯著相關(guān)性,但幾個(gè)這樣的位點(diǎn)構(gòu)成單倍型組合后能顯著影響產(chǎn)蛋性能,可能是由各位點(diǎn)之間協(xié)同作用導(dǎo)致的。

4 結(jié) 論

［1］ Liu W,Li D,Liu J,et al.A genome-wide SNP scan reveals novel loci for egg production and quality traits in white leghorn and brown-egg dwarf layers［J］.PLoS One,2011,6(12): e28600.

［2］Osei-Amponsah R,Kayang B B,Naazie A.Phenotypic and genetic parameters for production traits of local chickens in Ghana［J］.Anim Genet Re:2013,53:45-50.

［3］ Li H F,Shu J T,Du Y F,et al.Analysis of the genetic effects of prolactin gene polymorphisms on chicken egg production［J］. MolBiol Rep,2013,40(1):289-294.

［4］ 杜曉惠,李叢艷,劉俊瑩,等.雞催乳素受體基因多態(tài)性與就巢及產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析 ［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46 (12):2558-2565.

［5］ Knight P G,Glister C.Local roles of TGF-β superfamily members in the control of ovarian follicle development［J］.Anim Reprod Sci,2003,78(3):165-183.

［6］ Paulini F,Melo E O.The role of oocyte-secreted factors GDF9 and BMP15 in follicular development and oogenesis［J］.Reprod-DomestAnim,2011,46(2):354-361.

［7］ Yan C,Wang P,DeMayo J,et al.Synergistic roles of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarian function［J］.Mol Endocrinol,2001,15(6):854-866.

［8］ Chand A L,Ponnampalam A P,Harris S E,et al.Mutational analysis of BMP15 and GDF9 as candidate genes for premature ovarian failure［J］.Fertil Steril,2006,86(4):1009-1012.

［9］ Galloway S M,McNatty K P,Cambridge L M,et al.Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15)cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-sensitive manner［J］.Nat Genet,2000,25(3):279-283.

［10］儲(chǔ)明星,桑林華,王金玉,等.小尾寒羊高繁殖力候選基因BMP15和GDF9的研究［J］.遺傳學(xué)報(bào),2005,32(1):38-45.

［11］侯振平,印遇龍,黃瑞林,等.豬BMP15基因編碼區(qū)序列的克隆及測(cè)序研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2006,25(2):91-95.

［12］李春苗,黎壽豐,趙振華,等.BMP15外顯子1 SNPs檢測(cè)及其與邵伯雞母系產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012,43(11):1825-1832.

［13］Patil N,Berno A J,Hinds D A,et al.Blocks of limited haplotype diversity revealed by high-resolution scanning of human chromosome 21［J］.Science,2001,294(5547):1719-1723.

Association of BMP15 Gene Polymorphisms with Egg Laying in Wuxing-Yellow Chicken

FAN Wen-lei,LIU Hong-ju,ZHENG Mai-qing,LIU Ran-ran,LI Qing-he,WEN Jie,ZHAO Gui-ping*
(Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

In order to analyze the association of BMP15 polymorphisms with egg laying traits in Wuxing-Yellow Chickens. We sequenced exons of BMP15 and carried out polymorphism analysis for BMP15.The results showed that there were 4 SNPs in exon1 and 9 SNPs in exon2,among which C34T in exon1 and T424C in exon2 were both missense mutations,and resulted in mutation of Leu34Phe and Gly424 Ser,respectively.The relationship between polymorphic sites and egg production number of 300 d (EN-300 d)was analyzed by General Linear Model.In H line,three genotypes(CC,CT,TT)were found at C34 T mutation locus,in addition,individuals with TT genotype had significantly higher EN-300 d than that with CT genotype(P＜0.05).In L line,three genotypes(GG,GA,AA)were identified at G540A mutation locus and individuals with AA genotype has significantly higher EN-300 d than GA genotype(P＜0.05).No significant association was found between other mutations and EN-300 d in both lines(P＞0.05).Haplotype analysis showed that there was no significant association between diplotypes and EN-300 d in H line,while individuals with diplotypes L4L4 in block1 and L1L1 in block3 had significantly higher EN-300 d than others(P＜0.05 or P＜0.01)of L line.In conclusion,the polymorphisms of BMP15 have asignificant association with egg production of Wuxing-Yellow Chicken,indicating that the above loci and diplotypes could be potential DNA markers for improvement of egg production of chicken.

BMP15;SNP;Wuxing-Yellow chicken;egg production trait

S831.2

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0013-06

2014-11-15;

2014-12-29

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS04);國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-42)

凡文磊(1989-),男,河南人,碩士研究生,主要從事家禽抗病育種研究,E-mail:fwlei123@126.com

*通訊作者:趙桂蘋,研究員,E-mail:zhaogniping@caas.cn