桑葉、桑枝、桑椹多糖的提取及含量測(cè)定

劉英　章碧忠　章可謂

摘要：目的 提取純化桑葉、桑枝、桑椹多糖并測(cè)定其含量。方法 用水提醇沉法提取桑葉、桑枝、桑椹多糖。苯酚-硫酸紫外分光光度法測(cè)定桑葉、桑枝、桑椹多糖的含量。結(jié)果 果實(shí)桑椹中多糖含量最多，其次為桑葉，桑枝中多糖含量較少。結(jié)論 通過(guò)測(cè)定比較桑樹(shù)不同藥用部位的多糖含量，以充分開(kāi)發(fā)利用桑樹(shù)這一藥用資源，同時(shí)為深入開(kāi)發(fā)桑葉、桑枝、桑椹新資源提供有利的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：多糖；含量；提取

多糖在自然界中分布十分廣泛，大多數(shù)高等植物、微生物、地衣、海藻和動(dòng)物體內(nèi)均有豐富的多糖。多糖作為初級(jí)代謝產(chǎn)物，不僅具有結(jié)構(gòu)、支持與保護(hù)、能量來(lái)源和解毒作用等生物學(xué)功能，而且大多數(shù)具有明顯的藥理活性[1～3]。

桑葉、桑枝、桑椹為?？芃oraceae植物桑Morus alba L.的干燥葉，嫩枝和果實(shí)。桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、甘，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目的功效；歷代中醫(yī)藥書(shū)籍中記載桑葉能夠治療消渴癥，現(xiàn)代藥理研究表明桑葉有效成分之一桑葉多糖具有顯著的降血糖作用。其所含化學(xué)成分種類(lèi)較多，主要有多糖、黃酮類(lèi)化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑枝具有抗真菌活性、抗炎、降血糖等作用。桑椹子為桑的果穗，又名桑果、桑實(shí)、桑棗等。質(zhì)油滑，氣微，味微酸而甜。我國(guó)許多地區(qū)都有分布，中醫(yī)用于治療肝腎陰虧、消渴、耳鳴、關(guān)節(jié)不利等癥。

桑葉、桑枝、桑椹作為中醫(yī)常用藥有如此多的功效，目前有關(guān)桑樹(shù)單個(gè)藥用部位的多糖提取和含量測(cè)定略見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取桑葉、桑枝、桑椹多糖。苯酚-硫酸比色法對(duì)其三者多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)測(cè)定比較桑樹(shù)不同藥用部位的多糖含量，以期充分開(kāi)發(fā)利用桑樹(shù)這一藥用資源，同時(shí)為深入開(kāi)發(fā)桑葉、桑枝、桑椹新資源提供有利的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料、儀器及試劑

1.1原料 桑葉、桑枝、桑椹的干燥葉，嫩枝和果實(shí)。購(gòu)于杭州市老百姓大藥房。

1.2儀器 SPC22型紫外分光光度計(jì)，HH-S型電熱恒溫水浴鍋，超導(dǎo)熱風(fēng)干燥箱，循環(huán)水式多用真空泵，分析天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3試劑 95%乙醇，蒸餾水，苯酚，濃硫酸及其他試劑均為分析純，葡萄糖對(duì)照品，氯仿，正丁醇，活性碳。

2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1多糖的提取純化 分別稱(chēng)取桑葉、桑枝、桑椹各50.0 g，以6倍量蒸餾水先回流提取1h，趁熱過(guò)濾，得濾液和殘?jiān)?，將殘?jiān)偌?倍量蒸餾水提取45min。合并2次濾液，減壓濃縮至約150mL。再加入活性炭脫色，攪拌均勻，靜置過(guò)夜，多次過(guò)濾濾除活性炭，濾液再加入氯仿與正丁醇（4：1）混合液進(jìn)行萃取脫蛋白，取上清液加95%乙醇醇析，使溶液含醇量達(dá)80%，靜置沉降24h，醇析物抽干，得粗多糖。粗多糖沉淀用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，60℃以下烘干，即得多糖無(wú)定形粉末。精密稱(chēng)重備用。

2.2多糖含量的測(cè)定

2.2.1苯酚試劑的配制 取苯酚200g，加鋁片0.2g和NaHCO3 0.1g，蒸餾，收集182℃餾分，稱(chēng)取5g，加水100ml溶解混勻，即得。置棕色瓶?jī)?nèi)放冰箱中備用。

2.2.2最大吸收波長(zhǎng)的選定 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1.0 ml置于15 ml具塞試管中，加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于450～550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收度。確定最大吸收波長(zhǎng)為490nm。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取105℃烘至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.3 mg水溶解并定容至100ml容量瓶中，則其濃度為103ug/ml。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml置于15ml的具塞干燥試管中，加蒸餾水定容至1ml，再分別加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于其最大吸收波長(zhǎng)490nm處測(cè)其吸光度值。見(jiàn)表1，圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.2.4樣品溶液的制備 精確稱(chēng)取60℃干燥恒重的桑葉、桑枝、桑椹多糖各13.5mg，水溶解后定容到10ml容量瓶中，搖勻，做為多糖儲(chǔ)備液。濃度為1.35 mg/ml。

2.2.5樣品含量測(cè)定 精密吸取1.0ml樣品溶液置于10ml的具塞干燥試管中，分別加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于其最大吸收波長(zhǎng)490nm處測(cè)其吸光度值。用回歸方程計(jì)算各樣品中桑葉多糖的含量為3.29%，桑枝多糖的含量為2.80%，桑椹多糖的含量為7.48%。見(jiàn)表2。

2.2.6精密度試驗(yàn) 精密吸取1.0ml樣品溶液置于10ml的具塞干燥試管中，分別加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于其最大吸收波長(zhǎng)490nm處測(cè)其吸光度值，重復(fù)測(cè)定吸光度5次。見(jiàn)表3。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液1.0ml，按樣品測(cè)定方法操作，每隔15min測(cè)定一次吸光度。吸光度分別為：0.556，0.553，0.555，0.555，0.557，0.559，0.552，0.559。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品溶液在2h內(nèi)吸收度基本無(wú)變化。

2.2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品液0.3 ml，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液0.2ml，加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于其最大吸收波長(zhǎng)490nm處，測(cè)其吸光度值。見(jiàn)表4。

3討論

3.1苯酚-硫酸法的原理為多糖在濃硫酸作用下先水解成單糖分子，并迅速脫水成糠醛衍生物，糠醛衍生物再與酚性物質(zhì)如苯酚綜合成有色化合物，以比色法在適當(dāng)波長(zhǎng)處測(cè)定多糖含量[4～6]。

3.2本文對(duì)桑葉，桑枝，桑椹的含糖量測(cè)定方法進(jìn)行了摸索，最后確定了在490nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定的方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，是進(jìn)行該類(lèi)成分測(cè)定的較理想方法。

3.3多糖沉淀中的主要雜質(zhì)為色素、植物蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的去除方法有鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、加熱變性法、有機(jī)溶劑變性萃取法、膜過(guò)濾法。加熱變性法不能完全除去蛋白，等電點(diǎn)沉淀法要求操作精細(xì)，單一等電點(diǎn)不能滿(mǎn)足除盡蛋白的目的，膜過(guò)濾法費(fèi)時(shí)。加三氯乙酸去除蛋白質(zhì)的原理：蛋白質(zhì)在酸性條件下帶正電荷，與三氯乙酸的酸根結(jié)合形成沉淀[7～9]。

3.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意加濃硫酸時(shí)，要充分搖勻，至顏色穩(wěn)定（15min）后進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)證明本法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果在2h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)桑葉，桑枝，桑椹的含糖量的測(cè)定，表明桑椹中多糖的含量最高，其次為桑葉，桑枝較少。

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編輯/王海靜