龍麗坤+李飛武+李蔥蔥+武奉慈+宋新元

摘要：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON89034×NK603的3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米中CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白在各組織中的表達(dá)量，分別取苗期和心葉期葉片、吐絲期花粉和花絲、灌漿期籽粒、雌穗頂端和莖髓組織進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因品種中，外源基因在各組織中的表達(dá)顯示較高的一致性，均在葉片組織表達(dá)最高。轉(zhuǎn)化體同一組織中表達(dá)外源蛋白在品種間變異不明顯，組織間差異大于品種差異。

關(guān)鍵詞：復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米；ELISA；外源蛋白；時(shí)空表達(dá)規(guī)律

中圖分類號： S53035文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0029-05

自998年首例轉(zhuǎn)基因玉米被批準(zhǔn)商業(yè)化以來，轉(zhuǎn)基因玉米種植面積不斷擴(kuò)大，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展，新一代轉(zhuǎn)基因植物及復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物不斷涌現(xiàn)。20年，全球共有6個(gè)國家種植轉(zhuǎn)基因玉米，種植面積達(dá)到5 00萬hm2，占全球玉米種植總面積的32%。抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米種植面積近2年來不斷增長，202年種植面積達(dá) 2 029萬hm2，比20年增長09%。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米已逐漸取代了單一性狀轉(zhuǎn)基因玉米，成為市場主導(dǎo)[2]。然而，轉(zhuǎn)基因大面積種植后引起的生態(tài)環(huán)境安全等問題也引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。因此，對復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米在不同栽培條件下外源蛋白時(shí)空表達(dá)成為轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全評價(jià)的關(guān)注焦點(diǎn)之一[5]。本試驗(yàn)材料為孟山都公司選育的DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR等3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米品種，這3個(gè)品種均以MON89034和NK603為親本雜交選育而成，具有來自父本的CryA05和Cry2Ab2殺蟲蛋白基因和母本的C4-ESS蛋白外源基因，表達(dá)雙價(jià)抗蟲和耐除草劑的復(fù)合性狀。本研究采用ELISA方法對3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米不同時(shí)期、不同組織進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的實(shí)時(shí)檢測，研究復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲和耐除草劑基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。同時(shí)，以本品種的同型對照品種以及當(dāng)?shù)刂髟云贩N作為陰性對照開展外源蛋白組織表達(dá)測定，以期闡明雜交種外源蛋白時(shí)空表達(dá)規(guī)律，為雜交選育復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米環(huán)境安全評價(jià)方案提供參考依據(jù)。

材料與方法

材料和試劑

陽性轉(zhuǎn)基因玉米材料3個(gè)，品種名為DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR，同型對照陰性玉米樣品分別為DK007、DK008和NC6304，由美國孟山都公司提供。當(dāng)?shù)刂髟云贩N對照ZD958和C69為當(dāng)?shù)卮筇锿茝V材料，購于種子公司。3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米材料均為MON89034（雙價(jià)抗蟲）和NK603（耐除草劑）雜交選育的復(fù)合性狀品種。

主要化學(xué)試劑采購于Sigma公司。

2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)和取樣方法

2小區(qū)設(shè)計(jì)

NC6304YGRR和其同型對照NC6304、主栽品種對照ZD958種植于吉林省公主嶺市；DK007YGRR、DK008YGRR，同型對照DK007、DK008，主栽品種C69種植于廣西；每小區(qū)面積為30 m2（6 m×5 m），3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。

22播種時(shí)間與方法

吉林省202年5月2日播種，常規(guī)播種方式，播種后按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)耕作管理模式進(jìn)行管理。廣西壯族自治區(qū)202年4月20日播種，常規(guī)播種方式，播種后按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)耕作管理模式進(jìn)行管理。

23取樣方法

[3]分抽雄前、抽絲、灌漿初期和乳熟末期4個(gè)時(shí)期取樣，取樣部位：苗期葉片、心葉期葉片、花粉與花絲、籽粒、雌穗頂端和莖髓，取樣后用液氮速凍，-80 ℃低溫冰柜保存。

3ELISA試驗(yàn)方法

3樣品處理和蛋白抽提

當(dāng)在田間對測試材料的各個(gè)組織進(jìn)行采樣后，當(dāng)天放入實(shí)驗(yàn)室-80 ℃低溫冰箱中進(jìn)行保存，直至全部樣品采集完畢，開始樣品處理。樣品組織在處理時(shí)先粉碎成均勻的粉末樣本。樣品稱重后，對CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白用×BST進(jìn)行提取。提取的蛋白樣品在6 h內(nèi)進(jìn)行測試時(shí)，保存在 4 ℃ 條件下，否則用小管分裝保存在-80 ℃條件下。

32C4-ESS蛋白檢測方法

單克隆小鼠抗C4 ESS抗體用含50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖液和 05 mol/L NaCl的溶液稀釋至20 g/mL，每孔加00 L稀釋的抗體在96微孔板上固定，放入4 ℃冰箱孵育8 h以上。用× BST洗板3次，分別在各孔對應(yīng)加入C4-ESS蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、樣本提取液、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品緩沖液00 L/孔，37 ℃下孵育 h。秸稈、葉片、花粉、花絲和根樣品提取液使用× BST/0% BSA溶液稀釋；籽粒樣品使用× TBA稀釋?！?BST 洗板3次，每孔加入00 L過氧化物酶偶聯(lián)的抗C4 ESS抗體，37 ℃孵育 h。用× BST洗板3次，向孔內(nèi)加入00 L TMB，室溫靜置0 min，加入00 L 6 mol/L H3O4終止酶反應(yīng)。C4-ESS蛋白水平定量通過繪制0456～4600 ng/mL的C4-ESS蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線用內(nèi)插法確定。

33Cry2Ab2蛋白檢測方法

小鼠抗Cry2Ab2的捕獲抗體用包被緩沖液（92 μL單克隆抗體加到0 mL 50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3的緩沖液）稀釋，最終濃度為2 μg/mL，每孔加00 μL稀釋抗體在96微孔板上固定，放入4 ℃冰箱孵育 8 h 以上。用×BST洗板3次，分別在各孔對應(yīng)加入 00 μL Cry2Ab2蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、樣品提取液、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品緩[2]沖液（00 μL/孔），37 ℃孵育 h。×BST洗板3次，每孔加入00 μL生物素偶聯(lián)的山羊抗Cry2Ab2抗體和NeutrAvidin-HR（ierce）來檢測捕獲的Cry2Ab2?！?BST洗板3次，每孔加入00 μL TMB顯色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4終止酶活反應(yīng)。通過繪制濃度為029～7000 ng/mL的Cry2Ab2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，用內(nèi)插法完成定量。

34CryA05蛋白檢測方法[2]

山羊抗CryA05的捕獲抗體用包被緩沖液（50 mmol/L Na2CO3/NaHCO350 mmol/L NaCl）稀釋至終濃度3 μg/mL，每孔加00 μL稀釋抗體在96孔微孔板上固定，放入4 ℃冰箱中孵育8 h以上。用×BST洗板3次。進(jìn)行籽粒樣本分析時(shí)，向各孔加00 μL含9%脫脂奶粉（NFDM）的×BST，再進(jìn)行封閉，37 ℃孵育 30～90 min，用×BST洗板3次，其他組織樣本不進(jìn)行此步驟。分別在各孔對應(yīng)加入00 μL CryA05蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品提取液，37 ℃孵育 h。用×BST洗板3次，每孔加入 00 μL 生物素偶聯(lián)的山羊抗CryA05抗體和NeutrAvidin-HR（ierce）來檢測捕獲的CryA05。用×BST洗板3次，每孔加入00 μL HR底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4終止酶活反應(yīng)。通過繪制0438～4000 ng/mL CryA05蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，用內(nèi)插法完成定量。

4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

ELISA研究中采用Bio-rad iMarkTM 微孔板吸收光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白用波長450 nm時(shí)的吸光度和波長655 nm時(shí)的參考吸光度來確定其在樣品中的表達(dá)量，在計(jì)算時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)插法。蛋白的標(biāo)準(zhǔn)濃度用四參數(shù)邏輯曲線模型確定曲線，用內(nèi)插法確定CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白在各樣品中的含量，并將結(jié)果由ng/mL轉(zhuǎn)化為μg/g（鮮質(zhì)量）。數(shù)據(jù)用ELISA軟件進(jìn)行歸納分析。

2結(jié)果與分析

2組織中外源蛋白表達(dá)的差異顯著性分析

本試驗(yàn)的3個(gè)復(fù)合性狀品種分別在吉林省和廣西壯族自治區(qū)兩地栽種，3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)化體，均為MON89034和NK603的雜交選育品種。3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米材料的遺傳背景的外源基因具有來自父本MON89034的雙價(jià)抗蟲基因（[WTBX][STBX]CryA05、Cry2Ab2[WTBZ][STBZ]）和來自母本的NK603耐除草劑基因（[WTBX][STBX]C4-ESS[WTBZ][STBZ]）。采樣時(shí)期分別為苗期（V4）、心葉期（V8）、吐絲期（R）和灌漿期（R3），各時(shí)期采集的組織為V4 葉片、V8葉片、R花粉和花絲，R3籽粒、穗尖（雌穗頂端）、莖髓（雌穗著生節(jié)莖稈），在各小區(qū)中對每個(gè)組織材料隨機(jī)選取5株進(jìn)行蛋白提取。

對3個(gè)平行小區(qū)開展3次重復(fù)ELISA檢測，根據(jù)405 nm吸光度的數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對照其蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米植株中的外源蛋白表達(dá)含量。

表統(tǒng)計(jì)分析了3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因品種的 C4-ESS 蛋白在7個(gè)不同生長時(shí)期的組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，同一組織內(nèi)的蛋白表達(dá)在品種間多差異不顯著，特別是葉片組織，V4葉片（新鮮）和V8葉片（新鮮）的 C4-ESS 蛋白持續(xù)穩(wěn)定地高表達(dá)，均約為35 μg/g，其他組織在品種間或有差異，但各組織間表現(xiàn)了更大的差異顯著性，方差分析結(jié)果見表2。

表3分析了3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因品種的CryA05抗蟲蛋白在7個(gè)不同生長時(shí)期組織中的表達(dá)，該抗蟲蛋白在各組織中表達(dá)差異較大。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，3個(gè)品種同一組織蛋白表達(dá)量不同， 但差異均不顯著，而組織間V4葉片、V8葉[FL）]

可見，復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)化體組織表達(dá)外源蛋白在轉(zhuǎn)化個(gè)體間變異不明顯，其表達(dá)量與表達(dá)蛋白種類有關(guān)。組織間的差異大于品種差異，栽培種植條件也是影響其蛋白表達(dá)的原因之一。

22抗蟲和耐除草劑基因在轉(zhuǎn)化體中的蛋白表達(dá)

由圖、圖2、圖3可見，轉(zhuǎn)基因植株中耐除草劑蛋白 C4-ESS 在V4葉片、V8葉片、花粉、莖髓、穗尖、籽粒中表達(dá)量均高于CryA05、Cry2Ab2抗蟲蛋白，只有在花絲中3種蛋白表達(dá)量均較低的情況下，Cry2Ab2蛋白表達(dá)量略高于C4-ESS。

CryA4、Cry2Ab2 2種抗蟲蛋白的表達(dá)量在3個(gè)品種中表現(xiàn)趨勢也較明顯，CryA05抗蟲蛋白在V4葉片、V8葉片、花粉、穗尖組織中的表達(dá)量高于Cry2Ab2抗蟲蛋白；僅在3個(gè)品種的花絲、廣西品種DK007YGRR和DK008YGRR莖髓和籽粒中，Cry2Ab2表達(dá)的抗蟲蛋白量略高于CryA05。

因此，3個(gè)品種顯示的耐除草劑和抗蟲蛋白的組織表達(dá)規(guī)律一致，其外源蛋白的表達(dá)量可能與在其親本來源有關(guān)，在親本中的基因插入位置和表達(dá)調(diào)控可直接影響到其在雜交品種中的表達(dá)。

23植物各組織中外源蛋白的鮮質(zhì)量含量

如圖4、圖5、圖6所示，3個(gè)復(fù)合性狀品種DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR在各組織中表達(dá)情況也顯示出較高的一致性，即營養(yǎng)器官組織（V4葉片、V8葉片）的外源蛋白表達(dá)量均高于生殖器官（花絲、花粉、穗尖、籽粒、莖髓）。V4葉片中3種外源蛋白表達(dá)最高，V8葉片其次，這一結(jié)果可能與葉片中可溶性蛋白含量較高有關(guān)。[2]

在3個(gè)轉(zhuǎn)化體中，NC6304YGRR各時(shí)期的植物組織器官中CryA05蛋白表達(dá)量最高，DK007YGRR其次，DK008YGRR中表達(dá)相對較低。

在植物的營養(yǎng)器官中，NC6304YGRR的Cry2Ab2蛋白表達(dá)量最高，而生殖生長階段中NC6304YGRR生殖器官（花絲、花粉、穗尖、籽粒、莖髓）中Cry2Ab2蛋白表達(dá)量均低于DK008YGRR。

在苗期和心葉期，3種轉(zhuǎn)化體葉片中C4-ESS蛋白表達(dá)量最高，其中V4葉片時(shí)期略大于V8葉片時(shí)期，這種情況可能與前期轉(zhuǎn)化體篩選有關(guān)。這一時(shí)期葉片的高表達(dá)量為草甘膦噴施效果提供了有效保證。

24植物生長條件對轉(zhuǎn)化體外源蛋白組織表達(dá)的影響

NC6304YGRR是在吉林種植和栽培管理的玉米品種，DK007YGRR、 DK008YGRR在廣西栽培種， 因此植株生長的

環(huán)境條件有所不同。生長在吉林的NC6304YGRR 的CryA05蛋白表達(dá)量基本均大于生長于廣西的DK007YGRR、DK008YGRR。Cry2Ab2蛋白和C4-ESS蛋白表達(dá)量兩地各不相同，無明顯規(guī)律。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因品種各組織中的外源蛋白表達(dá)量存在差異，且在相同條件栽種的DK007YGRR、DK008YGRR蛋白表達(dá)量同樣存在差異，但差異較小。

3結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因植株外源基因蛋白在不同生育期不同組織器官表達(dá)不同[6]，既可能與外界栽培條件有關(guān)，也可能與外源基因整合的位點(diǎn)有關(guān)[7]。當(dāng)外源基因整合到與生長發(fā)育有關(guān)的基因附近，外源基因的表達(dá)就會受生長發(fā)育基因調(diào)控序列的調(diào)控，隨著生長時(shí)期的不同而發(fā)生變化。

本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因玉米各生長時(shí)期中，抗蟲Bt蛋白含量均未明顯減少，其抗蟲的表達(dá)量趨于穩(wěn)定，能夠持續(xù)地進(jìn)行抗蟲表達(dá)，因此能夠達(dá)到更好的抗蟲效果。在玉米不同生長發(fā)育階段的組織中，苗期葉片轉(zhuǎn)基因蛋白表達(dá)量明顯高于心葉期葉片。這可能與表達(dá)不同時(shí)期的環(huán)境條件有關(guān)，也可能與發(fā)育階段中基因的表達(dá)調(diào)控相互關(guān)聯(lián)。

在苗期和心葉期，3種轉(zhuǎn)化體中，葉片C4-ESS蛋白表達(dá)量最高，其中V4葉片時(shí)期略大于V8葉片時(shí)期，這種情況可能與前期轉(zhuǎn)化體篩選有關(guān)。這一時(shí)期葉片的高表達(dá)量為草甘膦噴施效果提供了有效保證。3個(gè)復(fù)合性狀品種的 C4-ESS [2]蛋白均來源于轉(zhuǎn)基因玉米品種NK603，因此筆者認(rèn)為，通過雜交育種的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體對其親本的安全評價(jià)可作為復(fù)合性狀雜交種的安全評價(jià)的數(shù)據(jù)參考，其外源基因表達(dá)可能直接決定親本多種雜交后代中外源基因的表達(dá)。

由于NC6304YGRR是在吉林種植和栽培的管理玉米材料，DK007YGRR、DK008YGRR在廣西栽種，因此植株生長的環(huán)境條件有所不同，組織間外源蛋白表達(dá)呈現(xiàn)差異。這與文獻(xiàn)中所述轉(zhuǎn)基因植物外源基因表達(dá)與生長自然環(huán)境條件、栽培管理措施密切相關(guān)的結(jié)論相一致。而在相同條件下栽種的DK007YGRR、DK008YGRR同樣存在表達(dá)蛋白量的差異，但差異較小。因此，組織表達(dá)與蛋白種類相關(guān)性更強(qiáng)，即與轉(zhuǎn)入的外源基因的本身構(gòu)建及插入基因組位置有顯著的相關(guān)性，該研究結(jié)果與其他作物的轉(zhuǎn)基因外源蛋白表達(dá)調(diào)控影響的研究[8-9]相一致。有研究表明，雜交本身對于外源基因的表達(dá)存在影響[0]，復(fù)合性狀玉米與其親本的表達(dá)差異和調(diào)控，有待于進(jìn)一步研究。

ELISA方法是直接檢測轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)外源蛋白表達(dá)量的手段之一，具有快速、簡單、低耗、結(jié)果客觀、易判定等特點(diǎn)。本試驗(yàn)的Bt蛋白和C4-ESS蛋白最低檢出量為05 ng/mL，靈敏度較高。每樣品均作平行檢測，并設(shè)立陰性和空白對照，提高了檢測的準(zhǔn)確性與可靠性。ELISA方法的檢測也受到檢測環(huán)境溫度、濕度的影響，因此每次檢測要在環(huán)境相同的條件下進(jìn)行，并且每次均須同時(shí)作空白及標(biāo)準(zhǔn)曲線，以減小誤差。穗尖、花絲及花粉的外源蛋白含量比其他部位的含量低，因?yàn)檫@些部分的可溶性蛋白本身含量就低，多為纖維素及其他物質(zhì)[2]。外源蛋白含量用 g鮮質(zhì)量中含量表示時(shí)，結(jié)果受樣品本身含水量的影響較大，導(dǎo)致有一定的誤差。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[ZK（#]謝樹章，楊小艷，林清，等 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米研究進(jìn)展 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，203，5（3）：36-4

[2]呂霞，王慧，曾興，等 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米研究及應(yīng)用 作物雜志，203（2）：7-2

[3]梅曉宏，許文濤，賀曉云，等 新型轉(zhuǎn)基因植物及其食用安全性評價(jià)對策研究進(jìn)展 食品科學(xué)，203，34（5）：308-32

[4]史曉利，楊益眾，蔡建華，等 Bt毒蛋白在轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中的表達(dá)及在亞洲玉米螟中的轉(zhuǎn)移積累 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20（）：2773-2777

[5]王軍輝，王念，張建國，等 轉(zhuǎn)Bt基因植物中外源基因時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)的研究現(xiàn)狀 生物技術(shù)通報(bào)，2004（2）：-4，8

[6]楊影麗，鐵雙貴，齊建雙，等 [WTBX][STBX]CryAc[WTBZ][STBZ]基因在玉米中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)[C] 202 年全國玉米遺傳育種學(xué)術(shù)研討會暨新品種展示觀摩會論文及摘要集，202

[7]王家寶，王留明，沈法富，等 環(huán)境因素對轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt殺蟲蛋白表達(dá)量的影響 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（6）：4-6

[8]王建武，馮遠(yuǎn)嬌，駱世明 Bt玉米抗蟲蛋白表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)及其土壤降解研究 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（）：279-286

[9][2]張永軍，吳孔明，郭予元 轉(zhuǎn)Bt基因棉花殺蟲蛋白含量的時(shí)空表達(dá)及對棉鈴蟲的毒殺效果 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，200，28（）：-6[ZK）]

[0][ZK（#]劉海濤，郭香墨，夏敬源 抗蟲雜交棉F代與親本Bt蛋白表達(dá)量及抗蟲差異性研究 棉花學(xué)報(bào)，2000，2（5）：26-263

張小四，李松崗，許崇任，等 轉(zhuǎn)Bt棉不同生長期及不同器官殺蟲蛋白表達(dá)量的免疫學(xué)方法測定 北京大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，36（4）：477-484

[2]李蔥蔥，劉娜，康嶺生，等 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量的研究 玉米科學(xué)，2006，4（3）：40-4