于一帆 朱小彬 葛會敏 陳云
摘要:細胞是生命活動的基本單位,各種蛋白質(zhì)都按照其功能有序地分布在細胞的每個分區(qū)中。蛋白質(zhì)的亞細胞定位是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容。目前植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位方法中應(yīng)用較普遍的是借助于報告基因表達產(chǎn)物來實現(xiàn)目標蛋白定位的融合報告基因定位法,其中綠色熒光蛋白應(yīng)用最為廣泛。綜述了基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物亞細胞定位方法,包括擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達、煙草葉片瞬時表達、洋蔥表皮細胞瞬時表達等,同時對上述幾種方法進行了比較分析。
關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì);亞細胞定位;綠色熒光蛋白;瞬時表達
中圖分類號: Q-33文獻標志碼: A
文章編號:002-302(204)2-0058-04
蛋白質(zhì)是生物功能的直接體現(xiàn)者,有序分布、動態(tài)調(diào)控的蛋白質(zhì)是保證生命個體正常生長發(fā)育的前提?;虮磉_產(chǎn)物在組織中的亞細胞定位是功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究內(nèi)容之一,是系統(tǒng)理解植物形態(tài)建成、生長發(fā)育以及對逆境的耐受性、抵抗性不可或缺的環(huán)節(jié),也是生物學(xué)家們初步推斷蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的重要依據(jù)。蛋白質(zhì)的亞細胞定位可采取多種方法,包括生物信息學(xué)預(yù)測、免疫膠體金標記[2]、多肽序列分析[3]以及與報告基因融合瞬時表達[4]等。目前植物蛋白的亞細胞定位應(yīng)用主要是借助于融合報告基因定位法,其中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GF)應(yīng)用最為廣泛。瞬時表達技術(shù)結(jié)合報告基因,可以有效跟蹤融合產(chǎn)物在細胞內(nèi)的運輸、亞細胞定位及代謝[5]。GF是水母(Aequorea victoria)體內(nèi)的天然蛋白,自994年Chalfie等揭示了該蛋白作為報告蛋白的潛在應(yīng)用價值[6]以來,已作為報告蛋白在多種植物、動物、微生物中成功獲得表達。由于GF作為報告蛋白不需抗體、輔助因子、酶底物等其他成分,也不影響宿主細胞,因而可以鑒定、跟蹤、分選表達GF的細胞;同時可以在活細胞中進行圖像分析,在固定細胞中進行檢測[7]。瞬時表達(transient expression)是指引入細胞的外源DNA與宿主細胞染色體DNA并不發(fā)生整合,而是隨載體進入細胞,約2 h左右可表達,基因產(chǎn)物在2~4 d內(nèi)即可被檢測出,是種快速研究基因表達、蛋白質(zhì)亞細胞定位及基因間互作的重要手段。瞬時表達能表達多種外源基因,具有時間短、重復(fù)性好等優(yōu)點,彌補了常規(guī)轉(zhuǎn)基因方式中周期長、轉(zhuǎn)化效率低等缺點[8]。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因相比,瞬時表達不需要整合到染色體上,因此具有簡單、快速、周期短、準確等優(yōu)點[9]。瞬時表達不受基因位置效應(yīng)、基因沉默的影響,表達效率較穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化率高。目前,植物瞬時表達系統(tǒng)已被陸續(xù)應(yīng)用到生物學(xué)研究中,如利用該系統(tǒng)進行基因功能的鑒定分析、發(fā)現(xiàn)新型強啟動子、蛋白質(zhì)互作、亞細胞定位等。亞細胞定位瞬時表達的宿主載體主要有擬南芥原生質(zhì)體、煙草葉片、洋蔥表皮細胞等。本研究對常用的基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物蛋白質(zhì)亞細胞定位方法進行總結(jié),并對相關(guān)研究進行展望,以期更高效地進行植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位。
擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達
擬南芥瞬時表達系統(tǒng)由en Sheen教授實驗室建立并完善[0]。該方法在蛋白定位、啟動子研究以及蛋白質(zhì)相互作用等方面很有效。擬南芥(Arabidopsis thaliana)是種模式植物,一直以來,擬南芥原生質(zhì)體都是植物基因工程、植物細胞學(xué)研究的經(jīng)典材料。原生質(zhì)體作為種細胞水平的研究系統(tǒng),由于沒有細胞壁等特點,它可以排除細胞之間的相互影響,單獨考察個細胞的全能性。原生質(zhì)體是個均一性程度很好的群體,并且在短時間內(nèi)就能獲得大量原生質(zhì)體。原生質(zhì)體是個理想的試驗系統(tǒng),由于不受植物細胞壁的限制,其質(zhì)膜經(jīng)一定處理可以攝取外源物質(zhì)(如細胞器、病毒、DNA等),是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體系統(tǒng)。研究表明,不同植物材料所得到的原生質(zhì)體可以保持原組織的生理生化特性,可以取代植物組織作為理想的試驗材料。
EG-Ca2 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法
聚乙二醇(EG)作為種高分子化合物,20%~50%的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng),使原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮。EG也能連接Ca2等陽離子,Ca2可在帶負電荷的質(zhì)粒DNA、EG之間形成橋,從而促使質(zhì)粒進入原生質(zhì)體。EG-Ca2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是擬南芥瞬時表達體系最常用的方法。該方法的技術(shù)流程是:擬南芥土培3~4周,生長過程中要求光周期較短(~2 h)。用解剖刀將符合要求的葉片切成細小的小段,溶于5 mL酶液中(纖維素酶0225 g,離析酶02 5 g,甘露醇64 g,pH值為57的MES 5 mL,55 ℃ 0 min,冷卻至室溫,再加入 mol/L CaCl2 5 μL、β-巰基乙醇525 μL、牛血清白蛋白BSA 50 μL,加dd H2O至5 mL)。避光抽真空 h,40 r/min慢搖4 h,然后80 r/min 搖5 min使小片段完全酶解。用等體積W5溶液(09% NaCl、0% CaCl2、0037% KCl、2% pH值為57的 MES)稀釋,過2層300目細胞篩,用W5溶液補體積至40~50 mL,00 g平甩離心5 min。棄上清后,用0 mL W5溶液輕柔清洗原生質(zhì)體。用 mL Mmg溶液(093% 甘露醇、0304% MgCl2、4% MES)重懸原生質(zhì)體。00 μL原生質(zhì)體加0 μg質(zhì)粒,然后加入等體積EG/Ca2 溶液(9% 甘露醇、0% CaCl2、40% EG 4000),緩慢輕柔混勻,25 ℃暗培養(yǎng)0~5 min。逐滴加入440 μL W5溶液。加 mL WI溶液(093% 甘露醇、4% MES、003% KCl)重懸,槍頭輕打混勻。鏡檢計數(shù)后置于培養(yǎng)板25 ℃過夜培養(yǎng),使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[2]。
2電擊穿孔法
在適宜的高壓電脈沖作用下,原生質(zhì)體細胞膜形成可修復(fù)的微孔,親水性物質(zhì)通過這些微孔進入細胞。Langridge等采用電擊技術(shù)分別把Ti質(zhì)粒、CAT基因等導(dǎo)入胡蘿卜原生質(zhì)體并獲得瞬間表達[3-4]。此后,在煙草、油菜、大豆、水稻、小麥、高粱、玉米等植物中都實現(xiàn)了原生質(zhì)體的電擊基因轉(zhuǎn)移及其表達。就操作而言,電擊法技術(shù)簡單方便。但是影響電擊基因?qū)搿⒈磉_的因素卻是相當(dāng)復(fù)雜的[5]。
3脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法
脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是將質(zhì)粒DNA包裹在脂質(zhì)體中,然后與原生質(zhì)體接觸融合而把外源DNA帶入原生質(zhì)體的種方法。脂質(zhì)體是種由磷脂、膽固醇、脂肪酸等脂類分子組成的球形膜囊結(jié)構(gòu),可將DNA、RNA等大分子物質(zhì)包在脂質(zhì)體內(nèi),免受細胞內(nèi)核酸酶的降解。脂質(zhì)體可做成單層、雙層或多層。脂質(zhì)體進入原生質(zhì)體主要發(fā)生在脂質(zhì)體與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的起始2 h,共培養(yǎng)90 min后,加入一定濃度的EG能提高脂質(zhì)體、原生質(zhì)體融合的頻率。
4植物病毒載體介導(dǎo)法
植物病毒大多為RNA,病毒載體介導(dǎo)的外源基因瞬時表達系統(tǒng)原理是將目的基因克隆到植物病毒基因組載體上的啟動子下游,通過體外轉(zhuǎn)錄后的直接侵染,或借助基因槍、農(nóng)桿菌等將其導(dǎo)入植物細胞。病毒在植物細胞間移動可以確保其進入較大范圍甚至是整株細胞中,方便在植株整體水平開展外源基因功能研究。病毒在植物細胞內(nèi)的大量復(fù)制,使外源基因的表達量獲得顯著提高,而且外源基因與病毒外殼蛋白的融合可以將外源基因產(chǎn)物展示在病毒顆粒表面,易于提取、分析[6]。植物病毒載體介導(dǎo)法的缺點是盡管植物種類繁多,且一些病毒可以侵染的宿主細胞范圍很寬,但是目前成功開發(fā)為轉(zhuǎn)化載體的病毒還很少,一些重要的作物類型還無法使用病毒侵染;病毒載體所能插入的外源片段較小,且病毒重組可能會影響表達產(chǎn)物的穩(wěn)定。
5其他轉(zhuǎn)化方法
[3]其他遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)如激光微素法[7]、顯微注射法[8]、超聲波法[9]等也正被逐步應(yīng)用到植物原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化上來。
2煙草葉片瞬時表達
煙草生長周期短、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟,且轉(zhuǎn)基因過程簡單易操作,常被用做試驗材料進行外源功能基因的亞細胞定位,加快了功能基因的研究進程。將定位載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌,利用注射法在煙草表皮細胞實現(xiàn)蛋白的亞細胞定位[20-22],使基因功能研究更加經(jīng)濟快捷。在煙草細胞或組織中瞬時表達外源基因,當(dāng)農(nóng)桿菌細胞滲透至葉片的細胞間隙時,可以高效率地將T-DNA導(dǎo)入植物細胞核內(nèi),達到表達外源基因并分析外源基因功能的目的[5]。采用在煙草葉片中表達外源基因的方法,最大的優(yōu)點是簡便快捷,且容易操作,但是表達外源基因的效率要低于轉(zhuǎn)基因等方法[23]。
2注射法
采用注射器直接將農(nóng)桿菌注射至葉片下表皮細胞間隙方法的技術(shù)流程是:煙草植株2 ℃土培5~6周,光周期為 4 h/d。[2]挑取農(nóng)桿菌單菌落于4 mL YEB培養(yǎng)基中,28 ℃ 200 r/min 過夜培養(yǎng)。吸取~5 mL菌液置于50 mL YEB培養(yǎng)基中,28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h。室溫下2 200 g離心0 min。棄上清,用50 mL滲透液(250 mg D-葡萄糖、5 mL 50 mmol/L MES、5 mL 2 mmol/L Na3O4·2H2O、5 μL mol/L 乙酰丁香酮)重懸至D600 nm為0,室溫放置至少3 h。用無菌 mL醫(yī)用注射器吸取菌液,將針頭刺入下表皮,輕輕將菌液注射進下表皮空隙中。煙草注射菌液后繼續(xù)在22~24 ℃下培養(yǎng),36 h 后進行熒光檢測[24-25]。
22浸染法
將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落培養(yǎng)至D600 nm為0,煙草嫩葉用HgCl2溶液消毒后剪成小塊或打孔,浸入菌液3~5 min,均勻搖晃,置于固體MS培養(yǎng)基表面,暗培養(yǎng)24~72 h,撕表皮,用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[26]。
3洋蔥表皮細胞瞬時表達
洋蔥表皮細胞結(jié)構(gòu)清晰,取材方便,是觀察細胞部分功能、外源基因瞬時表達的好材料。洋蔥表皮細胞中瞬時表達外源基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法2種。
3農(nóng)桿菌介導(dǎo)法
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)作為種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),已經(jīng)成為當(dāng)今植物遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法[27]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達快速有效,其原理是將目的基因插入載體,轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中,采用真空滲透或注射等方法使農(nóng)桿菌與植物材料細胞接觸,大部分T-DNA進入細胞核內(nèi)進行瞬時表達,幾天后即可檢測到外源基因的表達[28]。農(nóng)桿菌滲入法的技術(shù)流程包括載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌培養(yǎng)、針管注射浸潤、瞬時表達等部分。針對洋蔥表皮細胞的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法主要是先將含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落培養(yǎng)至D600 nm為06,2 800 g離心0 min,棄上清,用MS(0 mmol/L MgCl2、00 μmol/L乙酰丁香酮)重懸菌液。取洋蔥球莖內(nèi)4~7層表皮滅菌,撕 cm2 內(nèi)表皮置于農(nóng)桿菌液中20 min,將內(nèi)表皮平鋪于MS固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)6 h。用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[29]。
32基因槍轟擊法
[2]基因槍法(gene gun)介導(dǎo)的瞬時表達應(yīng)用較早,技術(shù)也較成熟?;驑尫ㄔ硎抢酶咚亠w行的微米或亞微米級惰性粒子(鎢或金粉),將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入受體細胞,并釋放出外源DNA,使DNA在受體細胞中獲得短暫的高水平表達,從而實現(xiàn)對受體細胞的瞬時轉(zhuǎn)化。目前,基因槍轉(zhuǎn)化包括鎢粉準備、DNA包裹鎢粉微粒以及基因槍轟擊等步驟[30-3]。
4討論
目前,上述幾種方法常被用于植物蛋白質(zhì)亞細胞定位瞬時表達研究。筆者對這幾種方法分別進行比較、總結(jié),并對各種方法的不足之處提出改進。
4以擬南芥為宿主載體
擬南芥作為模式植物,在生物學(xué)研究中十分重要。利用擬南芥進行原生質(zhì)體相關(guān)研究,能夠克服植物細胞工程領(lǐng)域的許多困難。原生質(zhì)體細胞作為遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體,可用于轉(zhuǎn)入基因的表達定位、功能分析等研究。除了可以攝取核酸大分子外,原生質(zhì)體還可以吞噬或融合細胞器以及細菌、病毒等微生物,這有可能開辟植物細胞工程研究的新領(lǐng)域[32]。然而該系統(tǒng)也有不足的地方:一方面是植物細胞壁被酶解掉了,因此不適合研究外膜蛋白,更無法研究細胞壁;另一方面,原生質(zhì)體本身存活時間一般不超過72 h,不能連續(xù)培養(yǎng),因此不能進行長期觀察,也不能用來研究與細胞周期有關(guān)的問題。應(yīng)用最廣泛的EG-Ca2 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的不足之處也是很明顯的。首先,用于提取原生質(zhì)體的擬南芥葉片只能選取符合要求的,且葉片需要切成 mm條狀,因此要求操作技巧較高。另外還需要長時間的抽真空、搖床慢搖等,耗時長。針對這些問題,前人提出的借助膠帶提取原生質(zhì)體的方法顯然更為高效,該方法對葉片的選擇沒有任何限制,而且無需對葉片進行切割,無需抽真空處理,水平慢搖也僅需20~60 min,相比上述方法省略了大量操作,節(jié)約了時間,葉片表皮也能較好地剝離,提取原生質(zhì)體的效率更高。
42以煙草為宿主載體
采用在煙草葉片中表達外源基因的方法最大的優(yōu)點是簡便快捷,不需要酶解制備原生質(zhì)體,但是表達外源基因的效率遠遠低于轉(zhuǎn)基因等方法。煙草葉盤較大,注射時操作簡單,目的基因與對照組可在同一張葉片上進行試驗,可以更好地控制變量,但是受侵染液濃度、侵染時間影響較大。傳統(tǒng)的注射法中,注射煙草葉片都是撕取煙草葉片的下表皮,制成臨時裝片置于熒光倒置顯微鏡下觀察。然而撕取煙草葉片下表皮需要較高的技巧、較長的時間,表皮一旦撕得不好會造成大量葉肉細胞附著,嚴重影響試驗結(jié)果,且觀察到葉肉細胞自發(fā)熒光的可能性極高,對定位結(jié)果干擾較大。筆者認為,使用打孔器對轉(zhuǎn)化的煙草葉片進行打孔,或切下5 mm×5 mm的小塊,移至加滿水的0 mL注射器中,用手指堵住出口處,用力抽吸幾下,讓葉片中充滿水,將葉片置于熒光倒置顯微鏡下直接觀察下表皮即可。該方法操作簡便,無需撕取表皮,節(jié)省了時間,且觀察時消除了葉肉細胞、自發(fā)熒光對定位結(jié)果的干擾。浸染法中,對煙草的瞬時表達體系優(yōu)化為:農(nóng)桿菌的D600 nm值為06左右,侵染6 min,共培養(yǎng)2 d,在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加 20 μmol/L 乙酰丁香酮,能得到較高的煙草瞬時表達率。
43以洋蔥為宿主載體
基因槍技術(shù)的優(yōu)點主要是不受宿主限制、受體類型廣泛。該法不僅可以原生質(zhì)體作為受體材料,而且可以完整細胞、組織等(如葉片、莖或根的切段、幼胚、愈傷組織、花粉細胞等)作為受體材料進行轟擊轉(zhuǎn)化,可控度高。基因槍轟擊過程中,可根據(jù)需要將射彈射入特定層次(位置)的細胞,有利于提高轉(zhuǎn)化效率?;驑尫ǖ娜毕菀彩秋@而易見的,首先是費用較高,基因槍轟擊對于植物傷害較大,轟擊位置不均勻,細胞容易因為部分受傷害過大而死亡;其次該方法還存在轉(zhuǎn)化效率低、外源基因向植物中插入不夠精確等缺點。對于基因槍法的優(yōu)化,不同植物品種之間存在較大差異。例如在水稻中,選用金粉,通過減小射擊距離,轟擊前用甘露醇進行預(yù)處理,可以提高轉(zhuǎn)化率[33]。在小麥中,通過大幅度降低金粉用量,進行滲透壓處理,同時選擇合適的受體,可以提高轉(zhuǎn)化率[34]。在大豆中,金粉尺寸為06 μm,轟擊時氦壓力值為 00 psi,真空壓力數(shù)為27 In·Hg,轟擊距離為9 cm[35]。在玉米中,最佳轟擊參數(shù)為: 350 psi氦氣壓力,25 In·Hg真空度,6 cm射擊距離[36]。目前常以洋蔥表皮細胞作為轉(zhuǎn)化材料,采用農(nóng)桿菌侵染法,從侵染液中乙酰丁香酮的濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間、共培養(yǎng)時間等方面探索最適轉(zhuǎn)化條件,但是該方法的不足之處在于對膜蛋白無法做到精準定位,需要使用30%蔗糖繼續(xù)進行質(zhì)壁分離試驗才能進一步驗證定位結(jié)果[37]。
5展望
蛋白質(zhì)的亞細胞定位與其功能發(fā)揮密切相關(guān)。細胞行使功能需要由特定空間分布的蛋白質(zhì)種類、含量、修飾的動態(tài)變化來體現(xiàn)。隨著多種蛋白質(zhì)亞細胞定位技術(shù)的建立與發(fā)展,目前已經(jīng)實現(xiàn)了從單個蛋白質(zhì)的亞細胞定位到高通量進行蛋白質(zhì)亞細胞定位的技術(shù)創(chuàng)新,并且從靜態(tài)定位研究發(fā)展到活體動態(tài)研究[38]。各種定位方法的綜合運用積累了大量亞細胞定位數(shù)據(jù),使人們了解細胞內(nèi)不同分區(qū)中蛋白質(zhì)分布的大致輪廓成為可能。近年來,水稻的細胞分區(qū)、蛋白質(zhì)組亞細胞定位研究已經(jīng)展開[39]。有學(xué)者嘗試用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)顯微測量技術(shù)來研究活細胞蛋白質(zhì)的空間分布,包括對共定位于活細胞特定部位的蛋白質(zhì)相互作用的研究,以此實時跟蹤特定蛋白質(zhì)在細胞生長發(fā)育過程中的表達、調(diào)控機制等[40-4]。蛋白質(zhì)亞細胞定位數(shù)據(jù)的積累完善,將為深入闡明蛋白質(zhì)的功能提供依據(jù)。
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