郭新榮，王瑞輝，李 娜，吳 濤

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)已成為危害公民的健康問(wèn)題、威脅人類生命和生存質(zhì)量的主要原因之一，已引起越來(lái)越多醫(yī)學(xué)研究者的重視。TBI動(dòng)物模型的制備對(duì)顱腦損傷的研究具有重要意義，隨著對(duì)TBI受傷機(jī)制不斷深入的研究，對(duì)TBI的模型復(fù)制要求也越來(lái)越高，需要尋找可控制性、重復(fù)性、穩(wěn)定性更好的模型制備方法。本研究利用電子顱腦損傷儀(eCCI)制備TBI大鼠動(dòng)物模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，報(bào)告如下。

材料與方法

1 動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物批號(hào):20121023)。雌性SD大鼠65只，體重220～240g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為5組:空白組(A組，10只)、模型1組(B組，15只)、模型2組(C組，15只)、模型3組(D組，15只)和假手術(shù)組(E組，10只)。考慮到造模動(dòng)物死亡率較高，因此B、C、D組各15只。

2 實(shí)驗(yàn)儀器及物品

戊巴比妥鈉、硫酸慶大霉素、紅霉素軟膏、多聚甲醛、生理鹽水;微型磨鉆;手術(shù)器械若干;大鼠腦立體定位儀(ST-3ND，成都儀器廠);全自動(dòng)脫水機(jī)(ZT-12J，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);包埋機(jī)(JB-L6，武漢俊杰電子有限公司);切片機(jī)(JJQ-P2016J，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);水浴鍋;毫針、棉簽、乙醇、一次性手套等耗材。

3 模型打擊設(shè)備

電子顱腦損傷儀(eCCI)是由美國(guó)弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)設(shè)計(jì)研制的專門針對(duì)TBI模型研究的打擊設(shè)備。其主要組件有:堅(jiān)固的鋁框、動(dòng)物平臺(tái)、控制器和撞擊頭，可以和各種型號(hào)的立體定位儀搭配使用;由控制器控制撞擊的速度，撞擊頭的組件部分含有感應(yīng)器，可以決定速率、撞擊深度及撞擊位置。

4 造模具體方法

術(shù)前禁食8h。實(shí)驗(yàn)時(shí)腹腔內(nèi)注射2%的戊巴比妥鈉(75mg/kg)進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚，正中切開(kāi)，剝離骨膜，暴露右頂骨，用微型磨鉆在冠狀縫后3mm、中線左旁2．5mm處［1］鉆一直徑為2mm的骨窗，保持硬膜完整。將大鼠移置到eCCI操作臺(tái)上，調(diào)試好機(jī)器參數(shù)(B組:打擊速度3m/s、深度3mm;C組:打擊速度4m/s、深度3mm;D組:打擊速度5m/s、深度3mm)，對(duì)模型組動(dòng)物全部進(jìn)行打擊，撞擊桿撞擊硬膜，使腦組織產(chǎn)生瞬間形變。打擊后向切口內(nèi)滴注4萬(wàn)U硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗。縫合頭皮，外涂抹紅霉素軟膏。B、C、D組動(dòng)物均完成造模后，放回籠中，單獨(dú)喂養(yǎng)。E組動(dòng)物只開(kāi)顱，不進(jìn)行打擊。

5 模型評(píng)價(jià)方法

利用光鏡、電子顯微鏡檢測(cè)損傷周圍腦組織，免疫組化法檢測(cè)腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)蛋白含量的變化。

結(jié) 果

1 光鏡檢測(cè)

A組和E組腦組織皮層細(xì)胞分布清晰致密、排列均勻、胞體飽滿，無(wú)壞死區(qū)，無(wú)纖維素滲出，胞核呈藍(lán)色、輪廓清楚，神經(jīng)元染色正常。B組:受傷皮質(zhì)可見(jiàn)出血、大量紅細(xì)胞逸出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。C組:腦組織出血較多，間質(zhì)嚴(yán)重水腫，腦組織壞死、結(jié)構(gòu)疏松、血管周圍間隙增寬。D組:腦組織出血面積較大、細(xì)胞腫脹明顯、神經(jīng)細(xì)胞呈篩狀排列、神經(jīng)元變性，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相對(duì)增多，可見(jiàn)嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象及泡沫細(xì)胞;部分血管擴(kuò)張，出現(xiàn)血管周圍水腫，有較多凋亡細(xì)胞出現(xiàn)(圖1)。

2 電鏡結(jié)果

電鏡下A組和E組的大鼠腦組織表現(xiàn)為:神經(jīng)元整體結(jié)構(gòu)完整清晰，線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器含量豐富，線粒體大量存在于胞質(zhì)內(nèi)、具有清晰可見(jiàn)的內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)、嵴排列整齊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)律整齊、含量較豐富;而顱腦損傷后，受損神經(jīng)元的整體結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，細(xì)胞膜受到損傷，線粒體超微結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞(如嵴斷裂、外膜變薄、氣球樣變、出現(xiàn)大量斷裂的膜碎片等)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少、擴(kuò)張、腫脹、泡狀樣改變、核蛋白體往往脫落于胞漿內(nèi)，細(xì)胞收縮變圓變小、失去微絨毛、與鄰近細(xì)胞脫離，胞漿濃縮。模型各組比較，隨打擊強(qiáng)度(速度)增大，腦組織受損越嚴(yán)重、病理變化越明顯(圖2)。

3 腦組織中NGF、BDNF蛋白表達(dá)

NGF蛋白免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀或者點(diǎn)狀沉積，主要分布在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布。A組和E組大鼠損傷腦組織大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿中NGF呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿中NGF呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表達(dá)明顯增多，且隨損傷打擊速度的增加也依次更多(圖3)。

BDNF蛋白免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀或者點(diǎn)狀沉積，主要分布在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布。A組和E組BDNF免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞在大腦皮質(zhì)部均有少量表達(dá)。B、C、D組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目依次增多，免疫陽(yáng)性物質(zhì)依次增加(圖4)。

4 統(tǒng)計(jì)處理及分析

免疫組化圖片采用陜西中醫(yī)學(xué)院分子生物與免疫組化實(shí)驗(yàn)中心Motic Images Advanced 3．0圖像分析系統(tǒng)，檢測(cè)NGF、BDNF免疫陽(yáng)性表達(dá)物情況，在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)相鄰視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，取5個(gè)視野的平均值。各組所獲得的數(shù)值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)來(lái)表示，采用SPSS17．0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，方差齊，組間兩兩比較采用LSD比較，如方差不齊，用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。

5 光鏡下計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 光鏡下各組大鼠腦組織出血量情況(×200)

圖2 電鏡下大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)(×8000)

圖3 光鏡下各組腦組織皮層NGF的表達(dá)(×200)

圖4 光鏡下各組腦組織皮層BDNF的表達(dá)(×200)

表1 各組SD大鼠腦皮層NGF、BDNF蛋白表達(dá)的比較(n=8，ˉx±s)

討 論

生理情況下中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)元的發(fā)育、活性、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的水平調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin，NTF)的表達(dá);但TBI發(fā)生后，在缺氧、低糖、缺血等條件下可導(dǎo)致皮質(zhì)和海馬NGF和BDNF表達(dá)升高;很多研究也證明NTF的反應(yīng)是防止神經(jīng)細(xì)胞死亡的自身保護(hù)機(jī)制。NTF能夠促進(jìn)周圍及中樞神經(jīng)元的分化、生長(zhǎng)及存活。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NTF包括NGF、BDNF和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Ⅲ、Ⅳ/Ⅴ、Ⅵ等，本研究選擇NGF、BDNF作為研究TBI模型制備的觀測(cè)指標(biāo)。

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的典型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，研究最為廣泛、深入。NGF在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、軸突的生長(zhǎng)及遞質(zhì)的合成和細(xì)胞的凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，NGF能夠促進(jìn)外周及中樞神經(jīng)元的分化、生長(zhǎng)和存活，在維持大腦正常的生理功能中發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)作用［2］。腦損傷后，早期反應(yīng)基因激活，炎性因子表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)NGF的表達(dá)。Lee等［3］的實(shí)驗(yàn)表明NGF與許多中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變密切相關(guān)，在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)細(xì)胞損傷后的恢復(fù)中起重要的調(diào)節(jié)作用。Dekosky等［4］研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷中NGF蛋白在大腦皮質(zhì)明顯增加，其mRNA于傷后1d增加5倍，認(rèn)為NGF在神經(jīng)損害后神經(jīng)再生和修復(fù)中起保護(hù)作用。近年研究證實(shí)［5］，NGF能選擇性地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能保護(hù)軸突受損的膽堿能神經(jīng)元免于死亡，還能誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長(zhǎng)，控制神經(jīng)細(xì)胞存活的數(shù)量和分化，維持成熟神經(jīng)元的存活，參與受損神經(jīng)元的修復(fù)。病理情況下，NGF還能保護(hù)神經(jīng)元避免損傷，促進(jìn)受損細(xì)胞的存活。BDNF是Heldt等［6］于1982年從豬腦中純化提取獲得的，結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)生長(zhǎng)因子相關(guān)，是一種小分子二聚體蛋白質(zhì)，多分布在大腦和海馬，在腦內(nèi)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種類型神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和再生都具有顯著作用并終身維持其功能。BDNF是一種腦保護(hù)因子，對(duì)神經(jīng)元起重要保護(hù)作用，有利于腦損傷的修復(fù)。

本研究為了評(píng)價(jià)利用eCCI制備的TBI模型效果，進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示造模效果，并進(jìn)一步使用免疫組化法檢測(cè)腦組織中NGF、BDNF蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示空白組和假手術(shù)組大鼠損傷腦組織大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿中NGF、BDNF均呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質(zhì)NGF、BDNF呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表達(dá)明顯增多，且隨損傷打擊速度的增加也依次增強(qiáng)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明利用eCCI制備TBI大鼠動(dòng)物模型，大鼠腦皮質(zhì)NGF、BDNF蛋白的含量確有變化且變化和打擊的速度有密切的關(guān)系。本造模方法具有控制性好、損傷程度能區(qū)分、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)操作簡(jiǎn)便，是一種較好的TBI動(dòng)物模型制備方法，可以廣泛應(yīng)用于TBI的實(shí)驗(yàn)研究。

［1］諸葛啟釧 主譯．大鼠腦立體定位圖譜［M］．3版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:23．

［2］Mobley WC，Rutkowski JL，Tennekoon GI，et al．Choline acetyl-transferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor［J］．Science，1985，229(4710):284．

［3］Lee TH，Kato H，Chen ST，et al．Expression of nerve growth factor and trk A after transient focal cerebral ischemia in rats［J］．Stroke，1998，29(9):1687-1697．

［4］Dekosky ST，Goss JR，Miller PD，et al．Upregulation of nerve growth fractor following cortical trauma［J］．Exp Neurol，1994，130(2):173-177．

［5］Carpentier PA，Palmer TD．Immune influence on adult neural stem cell regulation and function［J］．Neuron，2009，64(1):79-92．

［6］Heldt SA，Stanek L，Chhatwal JP，et al．Hippocampusspecific deletion of BDNF in adult mice impairs spatial memory and extinction of aversive memories［J］．Mol Psychiatry，2007，12(7):656-670．