南京地區(qū)動物源大腸桿菌超廣譜β—內(nèi)酰胺酶基因檢測

方光遠(yuǎn)+胡志華+蔣加進(jìn)+顧亞鳳+晏文梅+戴鼎震

摘要：為了研究江蘇省南京地區(qū)動物源大腸桿菌的耐藥特性，對南京地區(qū)發(fā)生大腸桿菌病的動物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，獲得38株大腸桿菌，采用PCR方法對38株不同動物源大腸桿菌TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，有6株大腸桿菌檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，檢出率為158%。其中3株為CTX-M-1型，2株為CTX-M-9型，1株為SHV型。只有部分大腸桿菌對少數(shù)抗生素高敏。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；基因檢測；南京地區(qū)

中圖分類號： S85261+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0255-03[HS][HT9SS]

[HJ14mm]

收稿日期：2014-10-30

基金項(xiàng)目：江蘇省南京市科技發(fā)展指導(dǎo)性計(jì)劃（編號：2012D006。

作者簡介：方光遠(yuǎn)（1965—，男，江蘇宿遷人，碩士，副教授，從事獸醫(yī)微生物學(xué)、獸醫(yī)生物制品學(xué)教學(xué)及研究。E-mail：fanggy126@126com。[HJ]

大腸桿菌廣泛存在于自然界中及動物體內(nèi)，正常情況下，動物腸道內(nèi)正常菌群中的大腸桿菌處于相對平衡的狀態(tài)，對于保持機(jī)體健康起到十分重要的作用；但一些特殊血清型的大腸桿菌對動物有致病性，能引起發(fā)病動物出現(xiàn)精神沉郁、厭食、下痢等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致發(fā)病動物死亡。隨著獸醫(yī)臨床β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用，動物源大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性越來越普遍，同時(shí)產(chǎn)生耐藥性的菌株中檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs的概率也越來越高。ESBLs主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌產(chǎn)生，能對β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行水解，從而導(dǎo)致此類細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性[1-3]。近年來，隨著3代頭孢菌素、單環(huán)酰胺類抗生素在臨床上的廣泛使用，各地產(chǎn)生ESBLs動物源大腸桿菌檢出率不斷增加[4-6]。為了研究動物源大腸桿菌的耐藥性，本研究采用PCR方法對近年來江蘇省南京地區(qū)分離鑒定的38株不同動物源大腸桿菌TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9 型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行檢測，現(xiàn)將試驗(yàn)過程及檢測結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

11材料

111病料來源

無菌采取近年來南京市范圍的養(yǎng)殖場、寵物醫(yī)院發(fā)生大腸桿菌病動物的相關(guān)病料，其中鴿病料7份，犢牛腹瀉病料27份，犬病料4份，送至金陵科技學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。

112培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂平板、SS瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、普通營養(yǎng)肉湯均由金陵科技學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室配制。

113微量生化發(fā)酵管

腸桿菌科細(xì)菌GY-15e生化編碼鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。微量生化編碼鑒定管包括硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素酶、半固體穿刺、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖。

114PCR擴(kuò)增引物及試劑[JP2]

根據(jù)文獻(xiàn)已發(fā)表的TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因序列，由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因片段上下游引物[7]。TEM上游引物P1：5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′；下游引物P2：5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增861 bp基因片段。SHV上游引物P1：5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′；下游引物P2：5′-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增821 bp基因片段。CTX-M-1上游引物P1：5′-CGCTTTGCGATGTGCAG-3′；下游引物P2：5′-ACCGCGATATCGTTGGT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增551 bp基因片段。CTX-M-9上游引物P1：5′-ATGGTGACAAAGAGAGAGTGCA-3′；下游引物P2：5′-CCCTTCGGCGATGATTCT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增868 bp基因片段。試劑包括 2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、TBE緩沖液等，均購自大連寶生物有限公司。

115藥敏紙片

抗生素藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏紙片包括：苯唑西林、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢噻肟、卡那霉素、妥布霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因共計(jì)12種。

12方法

121細(xì)菌分離培養(yǎng)

將取自鴿、犢牛腹瀉、犬的病料分別接種于SS瓊脂平板，貼上標(biāo)簽，37 ℃培養(yǎng)24 h。取生長典型的單個(gè)菌落分區(qū)劃線接種于SS瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板，穿刺接種于三糖鐵瓊脂斜面、營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察菌落形態(tài)及菌落在三糖鐵瓊脂斜面及營養(yǎng)肉湯中的生長情況。

122細(xì)菌染色鏡檢

取純培養(yǎng)獲得的單個(gè)菌落在潔凈載玻片上涂片，火焰干燥固定后，進(jìn)行革蘭氏染色，在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察。

123細(xì)菌的生化特性鑒定

取上述38株分離菌純培養(yǎng)物，分別接種于腸桿菌科細(xì)菌GY-15e生化編碼鑒定管硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素酶、半固體穿刺、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24 h，觀察結(jié)果。

124細(xì)菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測

DNA模板制備：分別取37 ℃培養(yǎng)18～24 h的38株分離菌肉湯培養(yǎng)物2 mL，用冷凍離心機(jī)4 ℃ 10 000 r/min離心2 min，傾去上清液，加入無菌水2 mL混勻，再同上離心洗滌1次，傾去上清液，再加入無菌水2 mL混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?5 μL PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Mix 125 μL、上游引物及下游引物各1 μL、ddH2O 10 μL、DNA模板05 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR基因片段檢測：取PCR產(chǎn)物10 μL加樣到12 g/L瓊脂糖凝膠中，于110 V 50 mA 核酸電泳槽中電泳45 min，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因片段。endprint

125超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因陽性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)

對檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的6株大腸桿菌菌株按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在乙醇燈火焰旁，用滅菌接種環(huán)取上述大腸桿菌純培養(yǎng)物致密劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板表面，用無菌鑷子將各種藥敏紙片（直徑6 mm分別貼于培養(yǎng)基表面，每塊平板貼3種，呈等邊三角形，各片距離相等。每貼完1個(gè)藥敏紙片，鑷子要在火焰上灼燒，以保證無菌。放在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中24 h后取出觀察并測量抑菌圈直徑。細(xì)菌對藥物的敏感程度判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑大于20 mm 為極度敏感，15～20 mm為高度敏感，10～14 mm 為中度敏感，小于10 mm 為低度敏感，0 mm為不敏感。

2結(jié)果與分析

21細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

將取自鴿、犢牛腹瀉、犬的病料分別接種于SS瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h后，獲得38株細(xì)菌，均為圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、直徑3～4 mm的紅色菌落。上述38株細(xì)菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的單個(gè)菌落呈圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、無色半透明狀，直徑3～4 mm。接種于普通營養(yǎng)肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h后，肉湯呈渾濁狀態(tài)，底部有黏性沉淀。穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基斜面呈黃色，底部有大量氣泡，不產(chǎn)生H2S。

22細(xì)菌形態(tài)染色特性鏡檢結(jié)果

將上述38株細(xì)菌純培養(yǎng)后獲得的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢可見兩端鈍圓、散在革蘭氏陰性中等大小桿菌，大小為（1～3 μm×（04～07 μm。

23細(xì)菌生化特性鑒定結(jié)果

38株分離菌純培養(yǎng)物分別接種于腸桿菌科細(xì)菌 GY-15e 生化編碼鑒定管，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24 h，分離菌生化特性鑒定結(jié)果見表1。根據(jù)上述生化反應(yīng)結(jié)果，計(jì)算每株細(xì)菌鑒定總值，查《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊》對應(yīng)的編碼檢索表，可得鴿7株、犢牛腹瀉27株、犬4株病料中的細(xì)菌鑒定值均為06365，鑒定結(jié)果均為大腸桿菌。

[F（W18][HT6H][J]表1分離菌生化特性鑒定結(jié)果[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W8，W21W] 項(xiàng)目[B（][BHDWG12，W21W]分離菌株

[BHDWG12，W7。3W]鴿7株?duì)倥８篂a27株犬4株[BW]

[BHDG12，W8Q，W7。3W]硫化氫000

[BHDW]丙苯氨酸000

葡萄糖酸鹽000

蛋白胨水444

葡磷胨水222

枸櫞酸鹽000

尿素酶000

半固體穿刺222

葡萄糖產(chǎn)氣111

賴氨酸444

鳥氨酸222

棉籽糖001

山梨醇444

側(cè)金盞花醇000

木膠糖111

鑒定總值063650636506365[HJ][BG）F][F）]

24細(xì)菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測結(jié)果

測定結(jié)果表明，分離得到的4株犬源大腸桿菌中，2株1號、2號犬源大腸桿菌具有CTX-M-1型ESBLs基因片段，2株3號、4號犬源大腸桿菌具有CTX-M-9型ESBLs基因片段。在27株?duì)倥８篂a大腸桿菌中，有1株13號犢牛腹瀉大腸桿菌產(chǎn)CTX-M-1型ESBLs基因片段。在分離到的7株鴿大腸桿菌中，有1株9號鴿大腸桿菌具有SHV型ESBLs基因片段。所有菌株均未擴(kuò)增出TEM型條帶（圖1。

[F（W12][TPFGY1tif][F]

25超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因陽性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的6株大腸桿菌菌株按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表2。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，6株大腸桿菌對青霉素類藥物氨芐西林、苯唑西林均不敏感，產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性；對頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛大部分菌株不敏感，產(chǎn)生耐藥性；對氨基糖苷類藥物卡那霉素、妥布霉素不太敏感；4號犬大腸桿菌對頭孢噻肟產(chǎn)生耐藥性，其他5株菌較敏感；6株菌對諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星敏感度不一致，可能與不同動物使用上述3種藥物程度不同有關(guān)；5株菌對呋喃妥因均高度敏感。其中1～4號犬大腸桿菌對大多數(shù)抗生素都不敏感，耐藥性較強(qiáng)，這可能與寵物醫(yī)院濫用抗生素有關(guān)。鴿大腸桿菌雖然測定出具有SHV型 ESBLs 基因片段，但對多種藥物高度或中度敏感，具體原因有待進(jìn)一步分析。

[F（W16][HT6H][J][WTH]表2超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因陽性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W5，W24W]藥名[B（][BHDWG12，W24W]抑菌圈直徑（mm

[BHDWG3，W62，W32。5W]13號犢牛腹瀉Ecoli1號犬Ecoli2號犬Ecoli3號犬Ecoli4號犬Ecoli9號鴿Ecoli

[BHDG12，W5，W62，W32。5W]苯唑西林000000

[BHDW]氨芐西林000000

頭孢唑啉0000021

頭孢哌酮002014920

頭孢呋辛0000018

頭孢噻肟13151414021

卡那霉素01300018

妥布霉素9700017

諾氟沙星151817000

氧氟沙星0131511823

左氧氟沙星1720170022

呋喃妥因172216191916[HJ][BG）F][F）]

3結(jié)論與討論endprint

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 （ESBLs是一類由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，能使細(xì)菌對青霉素類， 第一代、第二代、第三代頭孢菌素β-內(nèi)酰胺類抗生素，氨曲南（不包括第四代頭孢菌素或碳青霉烯類產(chǎn)生耐藥性。ESBLs主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌產(chǎn)生，是該類細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素產(chǎn)生耐藥性最重要的機(jī)制。目前已發(fā)現(xiàn)200余種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs，根據(jù)編碼基因同源性不同分為：TEM（temoniera、SHV（sulphadryl variable、CTX-M（cefotaxime、OXA（oxacillin、其他5類。CTX-M型ESBLs主要由大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌等細(xì)菌產(chǎn)生，根據(jù)基因序列同源性不同，將 CTX-M 型ESBLs分為4組，分別為CTX-M-1組、CTX-M-2組、CTX-M-8組、CTX-M-9組。我國主要為CTX-M型，以CTX-M-1組與CTX-M-9組最為常見；其次為SHV型；歐美國家常見的TEM型ESBLs在我國罕見。本研究表明，38株動物源大腸桿菌ESBLs基因總檢出率為158%，其中3株為CTX-M-1型，2株為CTX-M-9型，1株為SHV型。只有部分大腸桿菌對少數(shù)抗生素高敏，說明含有ESBLs的大腸桿菌對常規(guī)抗生素已產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性；但大腸桿菌對氟喹諾酮類、呋喃類抗菌化學(xué)藥物敏感性較高，這與這些藥物抑制大腸桿菌的核酸復(fù)制有關(guān)。因此在治療大腸桿菌感染時(shí)，應(yīng)先通過藥敏試驗(yàn)對發(fā)病動物選用高度敏感藥物來進(jìn)行治療，才能取得滿意的效果。大腸桿菌的特點(diǎn)是易形成耐藥性，而且大腸桿菌可通過菌毛將其耐藥性質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌，所以大腸桿菌的耐藥性形成較快，環(huán)境中大腸桿菌耐藥性菌株越來越多，所以在使用藥物治療大腸桿菌病時(shí)，應(yīng)采用輪換用藥、穿梭用藥、聯(lián)合用藥的方法避免或延緩大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生[8-9]。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS][HJ175mm]

[1][（#]劉保光，肖尚修，吳華，等 鴨大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測及藥物敏感性分析[J] 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（9：188-191

[2]李蓓菡，張學(xué)英，李菁華，等 長春地區(qū)部分醫(yī)院革蘭陰性桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因類型及分布[J] 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，36（1：205-209

[3]周學(xué)章，張仁參，賈芳，等 寧夏牛源克雷伯菌和大腸埃希菌分離株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型檢測[J] 寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，31（3：260-263

[4]余婷，謝敏，冀智佩，等 寧夏地區(qū)牛源大腸埃希菌ESBLs檢測及耐藥性分析[J] 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（3：25-28

[5]張陸，蔣月，盛鵬飛，等 腹瀉犢牛大腸桿菌血清型抗菌藥物耐藥性耐藥基因鑒定及脈沖場凝膠電泳分型[J] 中國獸醫(yī)雜志，2013，49（9：15-17

[6]夏利寧，向發(fā)，郭慶勇，等 新疆不同地區(qū)牛源大腸桿菌耐藥性分析[J] 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（2：203-207

[7]苑麗，劉建華，胡功政，等 雞大腸桿菌TEM和CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型研究[J] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（20：4310-4316

[8]陳朝喜，田淑琴，郭偉娜 156株犬源大腸桿菌耐藥譜型分析[J] 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3：1467-1468

[9]張美君，廖曉萍，王秀梅，等 寵物源大腸桿菌的血清型和毒力基因及耐藥性調(diào)查[J] 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（8：601-605[HJ][FL]

[HT5”SS〗江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年第42卷第12期

[SQ5]

[HT6F]方金津，袁永剛，徐小波，等 杜洛克×山仔豬日糧中添加葡萄糖氧化酶的飼喂效果[J] 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（12）：258-259

doi：1015889/jissn1002-130220141208endprint