1株用于生物強(qiáng)化的高效反硝化菌的篩選鑒定

吳麗紅 李曉惠 楊芳 王丹

摘要：從生物脫氮工藝的反硝化段活性污泥中分離到7株反硝化菌，考察了其脫氮能力后優(yōu)選出代表菌株FH2，該菌在400 mg/L NO3--N濃度下，對(duì)NO-3-N的去除率為100%，且脫氮過(guò)程中亞硝酸鹽基本無(wú)積累，表現(xiàn)出了很強(qiáng)的脫氮能力，可作為生物強(qiáng)化法處理高濃度氨氮廢水的菌源。通過(guò)對(duì)該優(yōu)勢(shì)功能菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA的序列測(cè)定和同源性分析，結(jié)果表明該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。該菌反硝化能力強(qiáng)，且具有芽孢微生物的特點(diǎn)，以該菌做為菌源進(jìn)行生物強(qiáng)化反硝化脫氮研究有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：氨氮廢水；反硝化脫氮；生物強(qiáng)化；優(yōu)勢(shì)反硝菌；篩選鑒定

中圖分類號(hào)： X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0371-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-02-27

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：L2011225）。

作者簡(jiǎn)介：吳麗紅（1980—），女，遼寧阜新人，碩士，講師，從事污（廢）水生物處理研究。E-mail：wulihong1980@163com。

氮、磷是廢水中常見的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，是引起湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素。大量含氮廢水排入水體不僅引起水體富營(yíng)養(yǎng)化、造成水體黑臭，而且增加水處理的難度、成本，甚至對(duì)人類產(chǎn)生毒害。含氮廢水對(duì)環(huán)境的影響已引起研究人員的重視[1]。目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用物理法、化學(xué)法、生物法處理高濃度氨氮廢水，這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也都存在不足[2-4]。生物強(qiáng)化技術(shù)是向傳統(tǒng)的生物處理系統(tǒng)中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的濃度，增強(qiáng)其對(duì)難降解污染物的降解能力、提高降解速率、改善生物處理效果。投加的微生物可以是原處理體系中存在的，經(jīng)過(guò)馴化、篩選、富集得到的一定數(shù)量的微生物，也可以是外源微生物[7-8]。本試驗(yàn)采用初選-復(fù)選-優(yōu)選技術(shù)，從成功啟動(dòng)并穩(wěn)定運(yùn)行的厭氧-好氧脫氮生物反應(yīng)器中分離到1株高效功能菌，在考察了其反硝化能力的基礎(chǔ)上對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，旨在為后續(xù)的生物強(qiáng)化反硝化脫氮研究提供菌源。

1材料與方法

11菌種來(lái)源

本研究菌種來(lái)源于穩(wěn)定運(yùn)行的厭氧-好氧脫氮生物反應(yīng)器，其主體是厭氧/缺氧-SBR反應(yīng)器（實(shí)現(xiàn)COD去除及反硝化脫氮功能）和好氧SBR反應(yīng)器（實(shí)現(xiàn)硝化功能）（圖1）。這2個(gè)反應(yīng)器的活性污泥是完全分開的，反應(yīng)周期均為8 h，將2個(gè)反應(yīng)器運(yùn)行周期開始時(shí)間錯(cuò)開，使厭氧/缺氧-SBR反應(yīng)器厭氧期與好氧-SBR反應(yīng)器周期同時(shí)結(jié)束，沉淀上清液相互交換。厭氧/缺氧-SBR反應(yīng)器進(jìn)入缺氧期，好氧-SBR反應(yīng)器進(jìn)入下個(gè)周期。2個(gè)反應(yīng)器的有效容積均為15 L，活性污泥取自某城市污水處理廠二沉池，用人工合成的廢水進(jìn)行污泥馴化培養(yǎng)。反硝化反應(yīng)器成功啟動(dòng)后，進(jìn)水硝酸鹽濃度（NO-3-N）為80～240 mg/L，對(duì)NO-3-N的最終去除率接近100%。本試驗(yàn)取厭氧/缺氧-SBR反應(yīng)器（NO-3-N濃度為180 mg/L）活性污泥混合液進(jìn)行反硝化功能菌的篩選。

[F（W12][TPWLH1tif][F]

12方法

采用COD快速測(cè)定儀測(cè)定化學(xué)需氧量（COD），采用紫外分光光度法測(cè)定硝酸鹽含量，采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽含量，采用玻璃電極法測(cè)定pH值。

13功能菌的分離、純化與篩選

131分離培養(yǎng)基成分

20 g NO3，50 g葡萄糖，1 g 2HPO4，1 g H2PO4，02 g MgSO4·7H2O，15～20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水pH值為72 ～75[9]，121 ℃下滅菌20 min。

132分離純化

1321混合細(xì)菌平板培養(yǎng)

從反應(yīng)器內(nèi)取10 mL泥樣接入事先已滅菌、內(nèi)裝玻璃珠及90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在振蕩器上振蕩2 h，使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于水中，然后進(jìn)行倍比稀釋。用滅菌吸管分別吸取10-10～10-4稀釋度的混合菌稀釋液01 mL，分別接種到倒有固體培養(yǎng)基的平板上，用無(wú)菌玻璃刮刀涂布均勻，再倒1層45 ℃左右的培養(yǎng)基，進(jìn)行厭氧夾層平板培養(yǎng)。待上層培養(yǎng)基凝固后，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。

1322單菌落分離、純化培養(yǎng)

分別用無(wú)菌接種環(huán)對(duì)“1321”節(jié)平板中長(zhǎng)出的不同形態(tài)特征的單菌落在固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，反復(fù)幾次，直至獲得純菌落為止。以無(wú)菌接種環(huán)挑取上步平板上長(zhǎng)出的單菌落接種到滅菌試管斜面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出，置冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ陨喜僮骶跓o(wú)菌條件下進(jìn)行。

133菌株篩選

初篩：將分離純化得到的純菌株分別接種到裝有液體培養(yǎng)基（除不加瓊脂外成分同分離培養(yǎng)基的具膠塞試管內(nèi)，以保證較好的厭氧/缺氧環(huán)境。每株菌重復(fù)3管，置于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)15 d。15 d后測(cè)定培養(yǎng)液的NO3-N、NO2-N含量，得到具有反硝化脫氮能力的菌株。復(fù)篩：將初篩篩選出的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后無(wú)菌高速冷凍離心分離，等量接種到裝有200 mL試驗(yàn)用水的靜態(tài)試驗(yàn)裝置進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每天定時(shí)取樣，測(cè)NO3--N、NO2--N含量，[HJ175mm]比較其反硝化能力。由于所篩菌株為后續(xù)生物強(qiáng)化輔助技術(shù)提供菌源，所以復(fù)篩水質(zhì)應(yīng)結(jié)合反應(yīng)器實(shí)際運(yùn)行情況，進(jìn)一步提高硝酸鹽濃度，以篩選出反硝化能力強(qiáng)的功能菌。水質(zhì)除COD、NO3--N濃度不同外，其余與反應(yīng)器進(jìn)水一致，水質(zhì)如下：1 000 mg/L 葡萄糖（COD）、400 mg/L NaNO3（NO-3-N）、10 mg/L H2PO4 （PO3-4-P）、10 mg/L CaCl2、90 mg/L MgSO4·7H2O、30 mg/L NH4Cl （NH+4-N、2 mL/L微量元素（ CuSO4·5H2O30 mg/L、I 180 mg/L、MnCl2·4H2O 60 mg/L、NaMoO4·2H2O 60 mg/L、nSO4·7H2O 120 mg/L、CoCl2·6H2O 150mg/L、EDTA 10 000 mg/L）。pH值為72±02。[HJ]

134菌株優(yōu)選

通過(guò)復(fù)篩結(jié)果，優(yōu)選出1株反硝化脫氮能力最好的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)及菌株特性研究。

135菌株形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)

對(duì)優(yōu)選出的代表菌株進(jìn)行其單一菌種相關(guān)特性研究[10]，具體內(nèi)容見表1。

13616S rDNA的序列測(cè)定和分析

對(duì)優(yōu)選菌株在進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行16S rDNA的序列測(cè)定，從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步鑒定其屬種。細(xì)菌基因組DNA提取利用通用引物（正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1391R：5′-GACGGGC-RGTCWGTRCA-3′）擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因，PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min。委托生物工程公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

2結(jié)果與分析

21反硝化工藝運(yùn)行情況

以硝酸鹽為電子受體的反硝化脫氮工藝運(yùn)行歷時(shí)70 d，逐級(jí)提高進(jìn)水負(fù)荷過(guò)程中出水硝氮、亞硝氮的的含量及反硝化效果見圖2。在40 mg/L NO-3-N條件下啟動(dòng)反應(yīng)器，由于活性污泥本身有一定脫氮能力，1 d時(shí)少量去除NO-3-N，前6 d出水NO-3-N有逐漸減少趨勢(shì)，NO-2-N沒(méi)有大量積累，7 d時(shí)開始出水NO-3-N明顯減少，脫氮率達(dá)7665%，反應(yīng)器啟動(dòng)成功。為了穩(wěn)定微生物的反硝化效果，沒(méi)有急于提高進(jìn)水NO-3-N濃度，在 40 mg/L NO-3-N條件下，又運(yùn)行了 3 d，反硝化效果進(jìn)一步提升。在后續(xù)提高NO-3-N負(fù)荷過(guò)程中，提高進(jìn)水負(fù)荷當(dāng)天，出水變化幅度較大，表明每次提高負(fù)荷對(duì)活性污泥中的微生物有一定沖擊，且微生物數(shù)量可能暫時(shí)不能滿足更高負(fù)荷要求。進(jìn)水NO-3-N在60～220 mg/L 濃度范圍內(nèi)，系統(tǒng)對(duì)更高一級(jí)的進(jìn)水濃度適應(yīng)速度較快，基本上3 d時(shí)開始出水效果開始好轉(zhuǎn)，4 d、5 d時(shí)出水脫氮率超90%，出水NO-3-N濃度較低。當(dāng)進(jìn)水NO-3-N提高到 240 mg/L 時(shí)，對(duì)微生物的抑制作用較強(qiáng)，出水波動(dòng)較大，5 d 出水開始好轉(zhuǎn)，在該負(fù)荷下一共運(yùn)行了10 d，最終出水去除率為9553%。為了探究該裝置的進(jìn)水NO-3-N負(fù)荷極限，將進(jìn)水NO-3-N提高到260 mg/L后繼續(xù)運(yùn)行了9 d，出水脫氮率一直保持在70%左右，NO-3-N出水濃度大于 60 mg/L，NO-2-N大于15 mg/L。為了保證出水效果，該反應(yīng)裝置正常的進(jìn)水NO-3-N濃度不應(yīng)超過(guò)240 mg/L。[FL]

[F（W10][TPWLH2tif][F]

[FL（22]22分離篩選結(jié)果

221初篩結(jié)果從反硝化活性污泥中共分離出38株純菌株，通過(guò)菌株初選，篩選出19株具有反硝化效果的功能菌株。

222復(fù)篩結(jié)果將19株功能菌株等量接種到靜態(tài)試驗(yàn)裝置培養(yǎng)，每日定時(shí)取樣測(cè)定NO-3-N、 NO-2-N含量，再次比較其反硝化脫氮能力。有7株菌具有良好的目的物去除效果，這7株菌暫時(shí)分別命名為F5Y、FC、F、FC1、FRB、FH、FH2（圖3、圖4）。

在電子受體NO-3-N濃度為400 mg/L條件下，培養(yǎng)1 d后，各菌株對(duì)NO-3-N的去除能力有很大差異，效果最突出的是FC1、FH2，硝酸鹽去除率分別為875%，80%，同時(shí)，這2

[F（W11][TPWLH3tif；S+2mm][F]

株菌對(duì)亞硝酸鹽的積累也很少，硝酸鹽很快被代謝掉。3 d時(shí)硝酸鹽未被檢出，含量為零，亞硝酸鹽含量也很低。4 d時(shí)亞硝酸鹽全部被代謝。菌株FC對(duì)硝酸鹽的去除效果很好，其間亞硝酸鹽的積累現(xiàn)象不明顯，但反應(yīng)周期較前2株菌長(zhǎng)。由圖3可知，隨著時(shí)間的推移，其他菌株也具有硝酸鹽還原能力。隨著硝酸鹽含量的降低，其他幾株菌均出現(xiàn)了亞硝酸鹽累積（圖4），說(shuō)明這幾株些菌株僅具有將NO-3-N初步還原為NO-2-N的能力，[JP2]無(wú)法徹底進(jìn)行或尚未進(jìn)行進(jìn)一步的還原反應(yīng)，導(dǎo)致不能從反應(yīng)體系中徹底脫氮?？梢钥闯觯闒C1、FH2幾乎可以將初始濃度為400 mg/L的 NO-3-N全部還原，它們對(duì)NO-3-N的去除建立在將其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物基礎(chǔ)之上，具有完整的反硝化酶系，表現(xiàn)出較強(qiáng)的脫氮能力。

[F（W115][TPWLH4tif][F]

223菌株優(yōu)選結(jié)果

綜合考慮NO-3-N的去除率、去除速率及NO-2-N的積累情況，選取菌株FH2進(jìn)行后續(xù)研究。該菌對(duì)400 mg/L NO-3-N去除率達(dá)100%，且處理時(shí)間短，反應(yīng)過(guò)程中基本沒(méi)有NO-2-N積累，應(yīng)用性較好。

23菌株FH2形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)優(yōu)選菌株FH2進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

[F（W12][HT6H][J][WTH]表1菌株FH2形態(tài)特征及其生理生化試驗(yàn)結(jié)果[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG12，W142，S142W]菌落相關(guān)特性生理生化特性試驗(yàn)

[BHDWG12，W72，W7，S72，W7W][XXSX2-SX14]指標(biāo)特性[XXSX2-SX14]試驗(yàn)名稱結(jié)果

[BHDWG12，W72Q12，W7Q12，S72Q1，W7W][XXSX2-SX14]菌體形態(tài)桿狀[XXSX2-SX14]革蘭氏染色+

[BHDW]菌落形狀不規(guī)則芽孢染色+

隆起形狀扁平異染顆粒染色+

邊緣形狀毛玻璃狀鞭毛染色+

顏色 淡黃莢膜染色-

透明程度扁平需養(yǎng)性試驗(yàn)兼性厭氧

黏稠度毛玻璃狀硝酸鹽還原+

葡萄糖發(fā)酵+

觸媒試驗(yàn)+

V.P試驗(yàn)+[HJ][BG）F][F）]

2416S rDNA的序列測(cè)定和分析結(jié)果

為了進(jìn)一步確定菌株FH2的決定性屬性，在形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)手段，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定分析。將測(cè)得的序列采用Sequcecher軟件進(jìn)行拼接，去掉載體序列及重復(fù)序列，得到16S rRNA序列。全序列以BLAST軟件在GenBank（wwwncbinlmnihgov）中進(jìn)行相似性檢索，得到與菌株序列最相近的菌株。有以下6種菌的同源性達(dá)到99%：[JP2]

Bacillus cereus（No NC_0047221）、

Acillus thuringiensis serovar konkukian str （No NC_0059571）、

Acillus anthracis strsternechromosome（No NC_0059451）、

Bacillus anthracis strAmes（No NC_0039973）、

Bacillus weihenstephanensis BAB4（No NC_0101841）、

Bacillus pseudomycoides DSM 12442（No NC_0007451）。

通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果及16S rDNA的序列測(cè)定分析結(jié)果綜合分析，鑒定菌株FH2為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus（GenBank

登錄號(hào)： NC_0047221。

3結(jié)論

本研究從穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化裝置中（NO-3-N濃度為180 mg/L）通過(guò)初篩、復(fù)篩，篩選出7株反硝化功能菌。根據(jù)最終脫氮能力優(yōu)選出代號(hào)為FH2的菌株作為代表菌株，在靜態(tài)試驗(yàn)中該菌在400 mg/L NO-3-N濃度下最終去除率為100%，并且對(duì)NO-3-N代謝速率快，脫氮過(guò)程中基本沒(méi)有亞硝酸鹽的積累，體現(xiàn)出了很強(qiáng)的脫氮能力。對(duì)菌株FH2進(jìn)行了形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，并輔助分子生物學(xué)手段進(jìn)行了16S rDNA的序列測(cè)定，結(jié)果表明菌株FH2為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus（GenBank Accession No NC_0047221。分離到的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus本身的反硝化能力很強(qiáng)，且具有芽孢的微生物具有很強(qiáng)的抗逆性，在進(jìn)行生物強(qiáng)化應(yīng)用過(guò)程中可抵抗外界不良環(huán)境、適應(yīng)性強(qiáng)，易存活，所以該菌做為菌源進(jìn)行生物強(qiáng)化反硝化脫氮處理研究具有很好的應(yīng)用前景。在后續(xù)工作中應(yīng)進(jìn)一步研究該優(yōu)勢(shì)菌的脫氮特性及影響因子，為生物強(qiáng)化處理高濃度氨氮廢水提供菌源。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS][HJ17mm]

[1][（#]何巖，趙由才，周恭明 高濃度氨氮廢水脫氮技術(shù)研究進(jìn)展[J] 工業(yè)水處理，2008，28（1）：1-4

[2]姜瑞，曾紅云，王強(qiáng) 氨氮廢水處理技術(shù)研究進(jìn)展[J] 環(huán)境科學(xué)與管理，2013，38（6）：131-134

[3]崔樹軍，谷立坤，張建云，等 高氨氮廢水的處理技術(shù)及研究應(yīng)用現(xiàn)狀[J] 中國(guó)給水排水，2010，26（14）：26-29

[4]王艷捷，邱忠平，吳敏，等 “中老齡”垃圾滲濾液重金屬和氨氮的厭氧毒性[J] 環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2008，2（10）：1353-1356

[5]解宏端，馬溪平 生物強(qiáng)化技術(shù)提高焦化廢水處理效果的研究[J] 中國(guó)給水排水，2007，23（15）：90-93

[6]王建芳，趙慶良，林佶侃，等 生物強(qiáng)化技術(shù)及其在廢水生物處理中的應(yīng)用[J] 環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2007，1（9）：40-45

[7]熊貴琍，陳瑾，葉文衍 生物強(qiáng)化技術(shù)及其在水污染治理中的應(yīng)用[J] 環(huán)境科學(xué)與管理，2013，38（4）：82-86

[8]徐軍祥，楊翔華，姚秀清，等 生物強(qiáng)化技術(shù)處理難降解有機(jī)污染物的研究進(jìn)展[J] 化工環(huán)保，2007，27（2）：129-134

[9]周群英，王士芬 環(huán)境工程微生物學(xué)[M] 3版北京：高等教育出版社，2008：444

[10]東秀珠，蔡妙英 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M] 北京：科學(xué)出版社，2001：353-369[HJ][FL]