葛文松，范建高，李光明

小分子干擾RNA沉默高遷移率族蛋白B1抑制肝星狀細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成*

葛文松，范建高，李光明

作者單位：200092上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科

第一作者：葛文松，男，37歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事慢性肝病及炎癥性腸病診治的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:gewensong@126.com

【摘要】目的研究小分子干擾RNA（siRNA）干擾高遷移率族蛋白B1（HMGB 1）表達(dá)對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC）Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)的影響。方法將化學(xué)合成的HMGB 1基因特異性siRNA以脂質(zhì)體包裹，轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照，抽提細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)情況；采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)與定位；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平。結(jié)果轉(zhuǎn)染HMGB 1基因特異性siRNA的HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平顯著下調(diào)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也提示轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平較對(duì)照組明顯降低；在培養(yǎng)72 h時(shí)，上清液Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原水平分別較對(duì)照組下降了（46.36±3.82）%和（41.92±3.58）%（F=33.14，P<0.01；F=27.56，P<0.01）。結(jié)論HMGB 1特異性siRNA能高效抑制HSC-T6細(xì)胞膠原的合成和分泌，因而可能具有預(yù)防和治療肝纖維化的潛力。

【關(guān)鍵詞】肝星狀細(xì)胞；小分子干擾RNA；高遷移率族蛋白B1；膠原

肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HSC激活的始動(dòng)因素是肝臟損傷和炎癥反應(yīng)，而HSC激活的過(guò)程包括早期啟動(dòng)和后期持續(xù)激活，激活的“持久性”是維持HSC激活狀態(tài)及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），尤其是I型和Ⅲ型膠原的必要條件。近年來(lái)，研究表明高遷移率族盒染色體蛋白B1（Highmobility group box chromosomal protein 1，HMGB 1）在急、慢性肝損傷的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用[1，2]。本課題組先前研究表明小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）HMGB1能高效抑制HSC-T6細(xì)胞HMGB1基因及蛋白水平表達(dá)[3]。本研究旨在進(jìn)一步探討siRNA沉默HMGB1后對(duì)活化的HSC表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的影響，以明確抑制HMGB1表達(dá)對(duì)肝纖維化發(fā)生的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞由美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校（San Francisco General Hospital，USA，UCSF）肝臟中心實(shí)驗(yàn)室Friedman教授惠贈(zèng)，其表型為活化的HSCs；RNA提取試劑盒和MTT均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；鼠抗人HMGB1單克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；兔抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG二抗為上海優(yōu)寧維公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的驢抗鼠二抗為美國(guó)Jackson Laboratories公司產(chǎn)品；所有siRNA均由上海諾百生物科技有限公司合成。

1.2引物設(shè)計(jì)依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，結(jié)合HMGB1基因序列特征，設(shè)計(jì)siRNA-HMGB1序列：正義鏈5'-ACCGGGCGAGCATCCTGGCTTATTTCAAGGAATA AGCCAGGAGCTCGCCCTTTTTC - 3'；反義鏈3'-CCGCTCGTAGGACCGAATAAAGTTCTCTTATTCG GTCCTACGAGCGGGAAAAAGAGCT-5'，序列兩端包含BpiⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。

1.3分組實(shí)驗(yàn)分為siRNA HMGB1組：轉(zhuǎn)染siRNA HMGB1特異性干擾目的基因HMGB1的表達(dá)；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空白Lipofectamine 2000，以等體積的無(wú)牛血清雙抗RPMI 1640補(bǔ)齊反應(yīng)體系；空白對(duì)照組：以等體積的無(wú)牛血清無(wú)雙抗RPMI 1640培養(yǎng)液代替轉(zhuǎn)染液，代表轉(zhuǎn)染前水平。

1.4 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%密度時(shí)進(jìn)行傳代。轉(zhuǎn)染前24 h，傳代至24孔培養(yǎng)板，每孔1×105細(xì)胞。取HSC-T6細(xì)胞，用無(wú)牛血清雙抗培養(yǎng)液分別稀釋Lipofectamine2000和siRNA至所需濃度（siRNA終濃度為20 μmol/L）。將稀釋的siRNA和Lipofectamine 2000各取10 μL混勻，靜置20 min，使形成穩(wěn)定的siRNA-脂質(zhì)體混合物，將上述混合物加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6h后，更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)的檢測(cè)采用Western blotting法，取HSC-T6細(xì)胞6×106個(gè)，PBS洗滌后，提取胞質(zhì)蛋白，采用BCA法行蛋白定量，與等體積的2×SDS上樣緩沖液混合。取50μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜、封閉，分別加入抗Ⅰ型和抗Ⅲ型膠原抗體（1：500），4℃孵育過(guò)夜，洗滌后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：1 000），室溫孵育3 h，經(jīng)ECL檢測(cè)、曝光和顯影。

1.6細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)與定位檢測(cè)采用免疫熒光法，將干擾組和空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的六孔板從培養(yǎng)箱中取出，將6孔板中蓋玻片取出，在PBS中蘸洗10次，吸干多余液體，再放入每孔裝有2 ml多聚甲醛（CH2O）的六孔板中，室溫固定10～15 min。取出固定好的蓋玻片，在PBS中蘸洗20次，將其放在載玻片上，分別滴加抗Ⅰ型和Ⅲ型膠原抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBS中蘸洗后再滴加熒光二抗，常溫避光放置1h。PBS中蘸洗20次，封片。在激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM510，Carl Zeiss AG，Oberkochen，Germany）下觀察膠原表達(dá)與定位情況。

1.7培養(yǎng)上清液膠原水平檢測(cè)取培養(yǎng)3 d的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μL，采用ELISA法檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，二組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 siRNA HMGB1對(duì)細(xì)胞膠原表達(dá)的抑制作用轉(zhuǎn)染siRNA HMGB1的HSC-T6細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型膠原分別被抑制了（52.26±4.48）%（F=19.36，P<0.01）和（41.24±3.29）%（F=17.21，P<0.01），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)無(wú)顯著性變化（圖1）。

M C1 C2 R1 R2

Collagen1

2.2 siRNA HMGB1抑制HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)與定位情況使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)斷層掃描觀察，以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6'-diamidino-2-phenylindole，DAPI）襯染細(xì)胞核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活化的HSC細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原分布廣泛，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，經(jīng)軟件融合（Merge）后，兩者染色區(qū)域分布清晰。經(jīng)siRNA HMGB1干擾后，細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)明顯減弱（圖2、圖3）。

2.3 HSC培養(yǎng)上清液Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量變化的比較HMGB 1 siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞72 h后Ⅰ型膠原水平較對(duì)照組顯著下降約（46.36±3.82）% （F=33.14，P<0.01）；Ⅲ型膠原水平比對(duì)照組下降約（41.92±3.58）%（F=27.56，P<0.01，表1）。

3　討論

肝纖維化是一個(gè)慢性的病理過(guò)程，其發(fā)生發(fā)展與過(guò)多的炎性細(xì)胞因子及其引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4～5]。目前認(rèn)為，HSC激活及ECM的肝臟沉積是導(dǎo)致肝纖維化的主要原因[6]。HSC作為肝纖維化體外細(xì)胞研究已有數(shù)十年歷史，在肝纖維化的形成中HSC是ECM形成的重要細(xì)胞[7]。因此，很多抗肝纖維化策略都聚焦于抑制HSC的活化、增殖及合成功能。

HMGB1是人們?cè)缭?0年前就發(fā)現(xiàn)的一種非組蛋白核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白。HMGB1廣泛分布于淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織中。起初人們認(rèn)為它在細(xì)胞核內(nèi)能與DNA結(jié)合，對(duì)DNA重組、修復(fù)、復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)HMGB1不僅在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，而且它被釋放到胞外時(shí)可作為一種有效的炎癥介質(zhì)誘發(fā)和進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的發(fā)生，是一種重要的炎癥因子。HMGB1蛋白與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究己經(jīng)證實(shí)，HMGB1蛋白可以由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放，也可以由被激活的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞主動(dòng)分泌到細(xì)胞外，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。起初的研究發(fā)現(xiàn)，全身感染所致內(nèi)毒素血癥和腫瘤壞死因子的釋放能刺激巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1，此后又證實(shí)多種炎癥刺激可誘導(dǎo)巨噬/單核細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1。胞外的HMGB1既可作為細(xì)胞因子參與信號(hào)傳導(dǎo)，又能進(jìn)一步通過(guò)引發(fā)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和血管黏附分子，使炎細(xì)胞發(fā)生趨化作用，削弱上皮細(xì)胞的功能等啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[8]。HMGB1也參與部分信號(hào)傳導(dǎo)途徑。研究表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（Receptor for advanced glycation end-products，RAGE）與HMGB1具有高親和力，是HMGB1的主要受體[9]。當(dāng)HMGB1與RAGE結(jié)合后，可引發(fā)MAPK磷酸化（包括p38MAPK、JN K1/2、ERK1/2）、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和活化蛋白21的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使許多炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-8等表達(dá)加強(qiáng)和釋放增多而啟動(dòng)炎癥或使炎癥惡化[10]。由此可見(jiàn)，HMGB1參與組織損傷/炎癥反應(yīng)/凋亡/免疫反應(yīng)等多種病理過(guò)程，HMGB1有可能成為抗炎和防止組織損傷的重要靶點(diǎn)。

越來(lái)越多的研究提示HMGB1參與多種肝臟疾病的炎癥過(guò)程，如在肝缺血/肝移植大鼠，均可發(fā)現(xiàn)HMGB1表達(dá)顯著升高[11，12]。HMGBl mRNA在乙型肝炎患者肝組織的表達(dá)情況及其與病情嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系也提示HMGB1與慢性乙型肝炎病情嚴(yán)重程度成正相關(guān)，能反應(yīng)病情嚴(yán)重程度、預(yù)后及其轉(zhuǎn)歸，為此推斷HMGB1很有可能參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。我們?cè)谇捌诠ぷ髦幸舶l(fā)現(xiàn)肝纖維化時(shí)HMGB1表達(dá)增高，并與纖維化程度呈正相關(guān)，其原因可能是肝纖維化的多種炎癥刺激及細(xì)胞因子可誘導(dǎo)巨噬/單核細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1，胞外的HMGB1既能進(jìn)一步通過(guò)引發(fā)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，使炎細(xì)胞趨化，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，又可作為細(xì)胞因子參與MAPK、NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)，最終致使肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、降解減少而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[13]。更有研究表明HMGB1直接刺激成纖維細(xì)胞增殖而參與纖維化過(guò)程，而抑制HMGB1可有效治療纖維化疾病，如Hamada et al研究表明抑制HMGB1可有效減輕肺纖維化[14]。

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強(qiáng)大工具，化學(xué)合成siRNA能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)外介導(dǎo)同源基因沉默，并具有治療作用[15]。已有很多采用該技術(shù)用于實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的干預(yù)研究[16，17]，并有應(yīng)用于體內(nèi)進(jìn)行抗肝炎病毒、肝纖維化及肝衰竭的治療研究[l8，19]。活化的HSC具有致炎、增殖、纖維形成的作用，抑制HSC活化與增殖已公認(rèn)為是防治肝纖維化形成的重要策略[20]。Ⅰ型和Ⅲ型膠原是ECM的主要成分，在肝纖維化時(shí)HSC是肝內(nèi)ECM的主要來(lái)源，因此抑制HSC合成與分泌膠原能延緩肝纖維化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNA干擾能使細(xì)胞膠原表達(dá)顯著下調(diào)。此外，抑制HMGB1表達(dá)的siRNA使培養(yǎng)上清液膠原含量明顯降低。

siRNA HMGB1能明顯減少細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成與分泌。因此，siRNA介導(dǎo)的HMGB1沉默可能對(duì)肝纖維化具有潛在的治療前景。

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（收稿：2015-01-14）

（本文編輯：陳從新）

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

Inhibition of small interfering RNA targeting high mobility group box chromosomal protein 1 on col-

lagen typeⅠandⅢin hepatic stellate cells in vitro

Ge Wensong，F(xiàn)ang Jiangao，Li Guangming. Department

of Gastroenterology，Xinhua Hospital，Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of synthetic small interfering RNA（siRNA）targeting high mobility group box chromosomal protein 1（HMGB1-siRNA）on collagen typeⅠandⅢin hepatic stellate cells （HSCs）in vitro. Methods Synthetic siRNA targeting HMGB1 was transfected into HSC-T6 cells by lipofectamine，and negative siRNA transfection and no transfection were used as negative control and blank control，respectively. After incubation with siRNA，total RNA and protein of HSC-T6 cells were extracted；the protein levels of typeⅠandⅢcollagen were determined by using Western blotting and immunofluorescence；Collagen type ⅠandⅢlevels in the supernatants were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Results The expression of collagen typeⅠandⅢwere significantly reduced after transfection of HMGB1-siRNA compared with in control or blank. The levels of collagen type I and typeⅢin the supernatants of transfected cells were decreased than in the negative control at 72 hours；the 1evels of type I collagen decreased by（46.36±3.82）%（F= 33.14，P<0.01）and the 1evel of typeⅢcollagen decreased by（41.92±3.58）%（F=27.56，P<0.01）at 72 hours when compared to the control. Conclusion Inhibition of HMGB1 by siRNA decreases the synthesis and the secretions of typeⅠandⅢcollagen in HSCs and this might has a potential effect in prevention and treatment of hepatic fibrosis.

【Key words】Hepatic stellate cells；Small interfering RNA；High mobility group box chromosomal protein 1；Collagen

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.002

通訊作者：李光明，E-mail：ligm68@126.com

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81200279）