秦子波，余小月，樂薇，榮建華，熊善柏，胡楊，2，3，4＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)交叉科學(xué)研究院，湖北 武漢 430070；3.國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)深圳營(yíng)養(yǎng)與健康研究院，湖北 武漢 430070）

引言

動(dòng)物皮、跟腱等組織中富含I型膠原，是優(yōu)良膠原的提取原料之一。I型膠原分子是由三條α螺旋鏈相互纏繞形成的右手超螺旋結(jié)構(gòu)，在模擬生理?xiàng)l件下I型膠原分子可以通過分子間的相互作用組裝成具有四分之一錯(cuò)位排列結(jié)構(gòu)的膠原纖維[1-3]。這種高度有序的膠原纖維組裝體由于具有適宜的理化特性、良好的生物誘導(dǎo)作用和低免疫原性，在皮膚、軟骨、跟腱等組織修復(fù)材料領(lǐng)域日益受到重視[4]。據(jù)閆鳴艷[3]和Liu等人[5]報(bào)道，膠原的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸組成以及自組裝條件（如溫度、膠原濃度）會(huì)對(duì)膠原自組裝行為產(chǎn)生顯著影響。為探究不同來源的膠原在不同條件下自組裝行為的差異，本文將以陸生和水生動(dòng)物中兩類來源最廣泛的原料（牛源和魚源膠原）為對(duì)象，綜合運(yùn)用圓二色譜（CD）、紫外光譜（UV）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）、氨基酸分析和動(dòng)態(tài)流變等手段對(duì)牛跟腱膠原和草魚皮膠原的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行比較，并研究濃度和溫度條件對(duì)兩類膠原自組裝行為的影響及組裝動(dòng)力學(xué)差異。本研究試圖從分子結(jié)構(gòu)差異-成纖維動(dòng)力學(xué)-宏觀流變學(xué)行為角度，闡明牛跟腱膠原與草魚皮膠原的自組裝行為差異，為牛跟腱膠原和草魚皮膠原分子的組裝行為調(diào)控及特性差異研究提供了一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料與儀器

豬胃蛋白酶（400 u/mg），購(gòu)于西格瑪奧德里奇（美國(guó)）公司；乙酸、氫氧化鈉、硫酸銨均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。FD-2A型真空冷凍干燥器，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；低溫恒溫槽，北京市聯(lián)華工業(yè)有限公司；J-1500型圓二色譜儀，日本佳司科公司；Nicolet470傅里葉變換紅外光譜，美國(guó)尼高力公司；紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；DHR-2型流變儀，美國(guó)TA儀器公司；J-26XP型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；Bio-Rad電泳儀，美國(guó)伯樂公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原提取方法

參考實(shí)驗(yàn)室方法提取牛跟腱膠原和草魚皮膠原[6]。首先，將剪碎的牛跟腱和草魚皮進(jìn)行脫脂和除雜蛋白處理。隨后，按照1∶50的料液比，將原料加入到含2%的胃蛋白酶（按干質(zhì)量計(jì)）的0.5 mol/L醋酸中，在4℃條件下攪拌浸泡48 h，然后經(jīng)離心、鹽析、透析和冷凍干燥后得到牛跟腱膠原和草魚皮膠原。

1.2.2 膠原性能表征

1.2.2.1 SDS-PAGE

取凍干后的膠原樣品，用0.5 mol/L醋酸溶解，配制成5 mg/mL膠原溶液。采用12%濃縮膠和5%分離膠，上樣量為15 μL?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色2 h，然后浸入脫色液中脫色至條帶清析，背景接近無色，最后用凝膠自動(dòng)成像儀掃描凝膠并保存圖像。

1.2.2.2 UV分析

將膠原溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中，配制成0.1 mg/mL膠原溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)膠原進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，分辨率為0.2 nm。

1.2.2.3 FT-IR測(cè)定

凍干的膠原樣品進(jìn)行傅立葉變換紅外光譜測(cè)試，波數(shù)范圍為4000～700 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為4 cm-1。

1.2.2.4 CD測(cè)定

用0.1 mol/L的醋酸配制成0.5 mg/mL的膠原溶液，在190～240 nm范圍內(nèi)、室溫條件下進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，比色皿光徑為l nm，掃描速度為10 nm/min，間隔1 nm。

1.2.2.5 氨基酸組成分析

取膠原40 mg置于塑料離心管中，加入6 mol/L HCl，在110℃下水解24 h后，過濾,定容至25 mL，取1 mL濾液蒸干，隨后加入1 mL的超純水蒸干，重復(fù)進(jìn)行兩次，再加入1 mL 0.02 mol/L HCl溶解蒸干后的殘留物，上樣前過0.22 μm的水相濾膜。通過氨基酸半自動(dòng)分析儀測(cè)定樣品的氨基酸組分及其含量。

1.2.3 膠原自組裝行為測(cè)試

1.2.3.1 膠原濃度對(duì)膠原自組裝行為的影響

取不同質(zhì)量濃度（1、1.2、1.5和2 mg/mL）牛跟腱膠原和草魚皮膠原溶液，在4℃下調(diào)節(jié)pH至7.0，在37℃下置于313 nm處實(shí)時(shí)測(cè)定膠原的吸光度。

1.2.3.2 溫度對(duì)膠原自組裝行為的影響

取2 mg/mL的牛跟腱膠原和草魚皮膠原溶液，在4℃條件下，調(diào)節(jié)pH至7.0，分別在25、37、42和50℃下，置于313 nm處實(shí)時(shí)測(cè)定膠原的吸光度。

1.2.3.3 自組裝速率的計(jì)算

運(yùn)用式（1）對(duì)膠原自組裝生長(zhǎng)期進(jìn)行擬合，該階段的斜率即為自組裝速率。

At為時(shí)間t時(shí)的吸光度，Ae為自組裝達(dá)到平衡時(shí)的吸光度，A0為初始吸光度，k是速率常數(shù)。

1.2.3.4 流變學(xué)性能測(cè)定

將自組裝后的膠原凝膠置于平板直徑為40 mm的流變儀中。設(shè)置頻率范圍為0.01～10 Hz，應(yīng)變?yōu)?%，溫度為37℃。記錄樣品存儲(chǔ)模量（G'）和損耗模量（G''）。

2 結(jié)果分析

2.1 牛跟腱膠原與草魚皮膠原結(jié)構(gòu)特性的比較分析

兩類膠原的SDS-PAGE如圖1a所示，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的電泳圖譜相似，均包含α1鏈、α2鏈、β鏈和γ鏈。相對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在130 ku附近的α1鏈電泳圖譜強(qiáng)度約為α2鏈的兩倍，與I型膠原的結(jié)構(gòu)一致[7-8]。紫外光譜結(jié)果表明，牛跟腱膠原和草魚皮膠原紫外掃描圖譜基本相似，在230 nm處存在較強(qiáng)的吸收峰，這主要是由羰基C=O的n→π*躍遷所致（圖1b）[9]。此外，兩種膠原在280 nm處無明顯的吸收峰，說明提取得到膠原中芳香族氨基酸含量較低，這與后續(xù)的氨基酸分析結(jié)果相一致。從圖1c可以看出兩類膠原的傅里葉變換紅外圖譜均存在I型膠原典型的5個(gè)特征酰胺帶，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的酰胺A帶分別出現(xiàn)在3434 cm-1、3436 cm-1處，與草魚皮膠原相比，牛跟腱膠原的酰胺A帶發(fā)生了部分紅移，這表明牛跟腱膠原分子中的部分基團(tuán)參與形成了更多的分子間或分子內(nèi)氫鍵[10]。此外，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的酰胺B帶分別出現(xiàn)在2931 cm-1和2934 cm-1處，這歸因于CH2基團(tuán)的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；酰胺I帶分別出現(xiàn)在1650 cm-1和1654 cm-1處，主要與多肽鏈上C=O的伸縮振動(dòng)有關(guān)[11]；酰胺II帶出現(xiàn)在1552 cm-1處，由N-H彎曲振動(dòng)和C-N拉伸振動(dòng)產(chǎn)生[12]；酰胺III帶出現(xiàn)在1241 cm-1附近，由C-N拉伸振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生[13]。同時(shí)，兩種膠原酰胺III帶的峰值與1454 cm-1的峰值比近似為1.0，這表明兩種膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)保持完整[14-15]。圓二色譜結(jié)果表明，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的負(fù)吸收峰均出現(xiàn)在199 nm處，正吸收峰分別出現(xiàn)在222 nm和221 nm處，且兩者的RPN值（正負(fù)吸收峰比值的絕對(duì)值）分別為0.197和0.179，表明兩類膠原均具有較為完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似（圖1d）[16-17]。氨基酸結(jié)果表明（表1），兩種膠原具有相似的氨基酸組成，甘氨酸（Gly）含量最高，占氨基酸總量的30%以上，其次為脯氨酸（Pro）與羥脯氨酸（Hyp），但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，牛跟腱膠原的亞氨基酸（Pro+Hyp）的含量為25.4%，明顯高于草魚皮膠原的亞氨基酸含量（19.42%），而亞氨基酸分子中的吡咯環(huán)有利于穩(wěn)定膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，亞氨基酸含量越高，膠原穩(wěn)定性越好[10，18]。

圖1 牛跟腱膠原和草魚皮膠原的SDS-PAGE圖（a）、UV圖譜（b）、FT-IR圖譜（c）和CD圖（d）Fig.1 SDS-PAGE patterns(a),UV spectra(b),FT-IR spectra(c)and CD curves(d)of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen

表1 牛跟腱膠原和草魚皮膠原氨基酸組成（%）Tab.1 Amino acid compositions of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen(%)

2.2 膠原濃度對(duì)膠原自組裝性能的影響

膠原濃度對(duì)自組裝行為的影響如圖2（a、b）所示?？梢钥闯?，自組裝過程分為三個(gè)階段，分別為成核期、生長(zhǎng)期和平衡期[19]。隨著膠原濃度的增加，膠原的自組裝進(jìn)程加快，這表明提高膠原濃度能夠加快膠原自組裝進(jìn)程[20]。當(dāng)膠原質(zhì)量濃度較低時(shí)（＜1 mg/mL），單位體積溶液中膠原分子數(shù)量較少且大多以游離形式存在，成核中心分子間的相互作用力較弱，導(dǎo)致組裝過程中形成的膠原纖維數(shù)量較少；而當(dāng)濃度增大時(shí)，體系中膠原的分子數(shù)量增多，從而有利于自組裝的進(jìn)行，尤其是當(dāng)牛跟腱膠原質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，在120 s內(nèi)膠原溶液的濁度值迅速上升至1.401，這與陳元昊[21]和閆鳴艷[22]等人的研究結(jié)果相似。圖2（c、d）中t1/2是指自組裝的半周期，半周期越短則膠原溶液自組裝速率越大；△h是初始吸光值與平衡期吸光值之差。從圖中可以看出，隨著膠原濃度的增加，膠原自組裝半周期（t1/2）縮短且△h變大，當(dāng)膠原質(zhì)量濃度由1 mg/mL升至2 mg/mL時(shí)，草魚皮膠原的t1/2從230 s縮短至140 s，△h則從0.467升至0.992；而牛跟腱膠原的t1/2從210 s縮短至60 s；△h則從的0.521升至1.144。這說明增加膠原濃度能夠加快膠原的自組裝進(jìn)程。

圖2 (a)和(b)為不同濃度膠原的自組裝濁度曲線（a為牛跟腱膠原、b為草魚皮膠原），（c）和(d)為膠原自組裝半周期（t1/2）及吸光度增加值（Δh)）（c為牛跟腱膠原、d為草魚皮膠原）Fig.2 (a)and(b)represent the turbidity curves of collagen self-assembly at different concentrations(a:bovine achilles tendon collagen,b:grass carp skin collagen).(c)and(d)represent the half cycle of collagen self-assembly(t1/2)and the increase in absorbance(Δh)(c:bovine achilles tendon collagen,d:grass carp skin collagen)

2.3 膠原濃度對(duì)膠原自組裝動(dòng)力學(xué)的影響

為了探究不同膠原濃度對(duì)膠原自組裝動(dòng)力學(xué)的影響，運(yùn)用式1對(duì)圖2（a、b）濁度測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，得到相應(yīng)的膠原自組裝動(dòng)力學(xué)擬合曲線（圖3、圖4）和膠原在生長(zhǎng)期的自組裝動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表2），其中k表示生長(zhǎng)期的組裝速率。

表2 不同質(zhì)量濃度下牛跟腱膠原和草魚皮膠原的自組裝參數(shù)Tab.2 Self-assembly parameters of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen at different mass concentrations

圖3 不同質(zhì)量濃度下牛跟腱膠原自組裝動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig. 3 Fitting curves of self-assembly kinetics of bovine achilles tendon collagen at different mass concentrations

圖4 不同質(zhì)量濃度下草魚皮膠原自組裝動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig.4 Fitting curves of self-assembly kinetics of grass carp skin collagen at different mass concentrations

隨著膠原濃度的增加，兩種膠原的自組裝速率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，當(dāng)膠原質(zhì)量濃度從1 mg/mL升至2 mg/mL時(shí)，草魚皮膠原的自組裝速率由0.15×10-4升至2.50×10-4，而牛跟腱膠原的自組裝速率則從0.32×10-4升至3.01×10-4。此外，在膠原濃度相同的情況下，牛跟腱膠原的自組裝速率要高于草魚皮膠原，這表明了兩種膠原在分子結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致膠原自組裝存在一定差異[23]。

2.4 溫度對(duì)膠原自組裝性能的影響

兩種膠原在不同溫度條件下的自組裝行為變化情況，如圖 5 所示。由圖 5（a、b）可知，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，草魚皮膠原發(fā)生自組裝，而牛跟腱膠原的自組裝行為較差，吸光度變化較小。當(dāng)溫度升至37 ℃，兩種膠原展現(xiàn)出高效的自組裝行為，且平衡期的濁度顯著升高，尤以牛跟腱膠原變化最為明顯，其濁度值由25 ℃時(shí)的0.270 升至1.407，而草魚皮膠原的濁度值由 25 ℃時(shí)的 1.175 升至1.337。當(dāng)溫度為42 ℃時(shí)，草魚皮膠原開始變性，不具備自組裝能力，而牛跟腱膠原雖具備自組裝能力，但與37 ℃時(shí)相比其自組裝性能開始下降，且平衡期的濁度值降至1.180。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，高溫引起牛跟腱膠原變性，三螺旋結(jié)構(gòu)解旋生成明膠，不具備自組裝能力，其成核期吸光度的上升是由于傳熱不均導(dǎo)致的[24]。由于陸生和水生生物的最適生長(zhǎng)環(huán)境以及亞氨基酸含量的不同，導(dǎo)致兩種膠原在不同溫度下的自組裝性能出現(xiàn)差異。從圖 5（c、d）中可以看出，在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高，膠原自組裝半周期（t1/2）縮短且△h變大。當(dāng)溫度從25 ℃升至37 ℃時(shí)，草魚皮膠原的t1/2從 360 s 縮短至140 s，△h則從 0.860 升至 0.992；而牛跟腱膠原的△h則從的0.137 升至1.144。這進(jìn)一步說明了升高溫度能夠加快膠原的自組裝進(jìn)程[25]。

2.5 溫度對(duì)膠原自組裝動(dòng)力學(xué)的影響

為了探究不同溫度對(duì)膠原自組裝動(dòng)力學(xué)的影響，運(yùn)用式（1）對(duì)圖 5（a、b）濁度測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到自組裝動(dòng)力學(xué)擬合曲線（圖6、圖7）和膠原在生長(zhǎng)期的自組裝動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表 3），其中 k 表示生長(zhǎng)期的組裝速率。由表3 可知，當(dāng)溫度為37 ℃，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的組裝速率分別達(dá) 到 最 大 值 3.01 ×10-4和2.50×10-4，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，牛跟腱膠原的組裝速率開始下降，草魚皮膠原發(fā)生變性，不具備自組裝能力，未獲得自組裝速率常數(shù)。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，未得到牛跟腱膠原的速率常數(shù)，說明牛跟腱膠原發(fā)生變性，也不再具有自組裝的能力。因此，適度提高溫度有助于膠原的自組裝，但溫度過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致膠原變性，使膠原無法進(jìn)行自組裝。金達(dá)麗的研究也表明在一定范圍內(nèi)提高溫度對(duì)膠原自組裝有促進(jìn)作用[26]。

圖5 (a)和(b)為不同溫度膠原的自組裝濁度曲線（a 為牛跟腱膠原、b 為草魚皮膠原），(c)和(d)為膠原自組裝半周期(t1/2)及吸光度增加值(Δh)(c 為牛跟腱膠原、d 為草魚皮膠原)Fig. 5 (a)and(b)represent the turbidity curves of collagen self-assembly at different temperatures(a:bovine achilles tendon collagen,b:grass carp skin collagen).(c)and(d)represent the half cycle of collagen selfassembly(t1/2)and the increase in absorbance(Δh)(c:bovine achilles tendon collagen,d:grass carp skin collagen)

圖6 不同溫度下牛跟腱膠原自組裝動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig. 6 Fitting curves of self-assembly kinetics of bovine achilles tendon collagen at different temperatures

圖7 不同溫度下草魚皮膠原自組裝動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig. 7 Fitting curves of self-assembly kinetics of grass carp skin collagen at different temperatures

表3 不同溫度下牛跟腱膠原和草魚皮膠原的自組裝參數(shù)Tab. 3 Self-assembly parameters of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen at different temperatures

2.6 動(dòng)態(tài)頻率掃描

圖8 為不同質(zhì)量濃度（1.5 mg/mL 和 2 mg/mL）下牛跟腱膠原和草魚皮膠原在37 ℃下組裝成凝膠后的動(dòng)態(tài)掃描曲線圖。在相同的濃度條件下，兩類膠原的存儲(chǔ)模量均高于其損耗模量，表明膠原分子組裝形成的凝膠具有明顯的彈性特征。在質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，牛跟腱膠原的彈性模量從0.98 Pa 快速上升至4.76 Pa，草魚皮膠原則從1 Pa 上升至4.1 Pa，牛跟腱膠原在同樣的頻率下其彈性模量大部分高于魚膠原，在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)榕Ｄz原中的亞氨基酸含量（Pro+Hyp）要高于草魚皮膠原，導(dǎo)致膠原組裝成凝膠的過程中其剛性較強(qiáng)[27]，該結(jié)果也與前文中氨基酸組成的差異相一致。

圖8 不同質(zhì)量濃度下（1.5 mg/mL 和2 mg/mL）牛跟腱膠原和草魚皮膠原在37 ℃下組裝成凝膠后的動(dòng)態(tài)掃描曲線圖（G'為存儲(chǔ)模量，G''為損耗模量）Fig. 8 The dynamic scan profiles of bovine achilles tendon collagen hydrogel and grass carp skin collagen hydrogel assembled at 37 ℃at different mass concentrations(1.5 mg/mL and 2 mg/mL) (G' is the storage modulus and G'' is the loss modulus)

3 結(jié)論

采用“酸-酶”結(jié)合法制備了具有良好三股螺旋結(jié)構(gòu)的牛跟腱膠原和草魚皮膠原，兩類膠原具有類似的光譜學(xué)特征和二級(jí)結(jié)構(gòu)，但其氨基酸組成存在一定差異，牛跟腱膠原的亞氨基酸（Pro+Hyp）含量比草魚皮膠原高約6%。膠原濃度和環(huán)境溫度對(duì)其自組裝行為有較大影響，隨著濃度增加，膠原自組裝進(jìn)程加快，自組裝后凝膠的動(dòng)態(tài)粘彈性升高。此外，在相同濃度下牛跟腱膠原的自組裝速率高于草魚皮膠原，且自組裝后膠原凝膠的動(dòng)態(tài)粘彈性較高。同時(shí)，在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度對(duì)膠原自組裝有促進(jìn)作用，而過高或過低的溫度都會(huì)對(duì)膠原自組裝產(chǎn)生不良影響。當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，牛跟腱膠原未進(jìn)行自組裝，而草魚皮膠原可以進(jìn)行自組裝，當(dāng)溫度升至37 ℃時(shí)，兩種膠原都展現(xiàn)出高效的自組裝行為。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，膠原會(huì)發(fā)生變性，牛跟腱膠原的熱穩(wěn)定性更高，這與其亞氨基酸組成密切相關(guān)，整體而言，牛跟腱膠原的自組裝效果優(yōu)于草魚皮膠原。