范金明 陳昌如 周亞俊 冒留留

(江蘇省如東縣豐利畜牧獸醫(yī)站,江蘇如東 226008)

轉(zhuǎn)基因雞禽流感抗病育種的研究進(jìn)展

范金明 陳昌如 周亞俊 冒留留

(江蘇省如東縣豐利畜牧獸醫(yī)站,江蘇如東 226008)

禽流感不僅對(duì)家禽生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失,更重要的還威脅到人類(lèi)安全,在該病防控研究方面,雖然通過(guò)不同亞型不同地區(qū)的流行情況制作了疫苗,但由于其變異性強(qiáng)等特性,防治效果并非完全有效,將轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于抗病育種為從根本上達(dá)到抗禽流病毒感染提供了可能,因此,筆者將家禽轉(zhuǎn)基因的制作方法和禽流感抗病育種的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了簡(jiǎn)單介紹。

雞;轉(zhuǎn)基因;禽流感;抗病育種

禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類(lèi)的感染和/或疾病綜合癥，自從19世紀(jì)80年代意大利大規(guī)模暴發(fā)禽流感造成重大經(jīng)濟(jì)損失以后，人們就開(kāi)始了對(duì)該病的研究[1]，我國(guó)在1997年香港大規(guī)模暴發(fā)H5N1禽流感病毒感染人并致人死亡的事件發(fā)生后更加加強(qiáng)了對(duì)禽流感的研究和重視[2]，也根據(jù)不同地區(qū)的禽流感流行情況研制出了不同亞型的疫苗，鑒于該病的變異性強(qiáng)、亞型多等原因，禽流感疫苗所取得的對(duì)該病的免疫效果一直不理想。面對(duì)越來(lái)越復(fù)雜的的禽流感流行現(xiàn)狀，如何多途徑的對(duì)該病的進(jìn)行根本性的防控，是目前迫切解決的問(wèn)題，因此研究抗禽流感病毒轉(zhuǎn)基因雞并進(jìn)行抗病育種，是一條禽流感防治的有效途徑，也是從根本上攻克禽流感病毒的一項(xiàng)重要技術(shù)。

1 轉(zhuǎn)基因家禽制作方法

1.1 精子載體法

精子在輸卵管內(nèi)與卵子結(jié)合時(shí)能準(zhǔn)確找到卵子的雌性原核的特性，直接采用外源DNA或陽(yáng)離子質(zhì)體包埋外源DNA與成熟精子共孵育后，通過(guò)人工授精獲得轉(zhuǎn)基因雞，這種方法簡(jiǎn)單、成功率高，具有較高的研究?jī)r(jià)值。Collares等運(yùn)用脂質(zhì)體和REMI改進(jìn)了精子攝取外源DNA量，并成功制備轉(zhuǎn)因雞。Collares等用運(yùn)用SMGT法制備帶有pEGFP-N1基因的轉(zhuǎn)基因雞，通過(guò)PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，新生雛雞的轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)也很可觀。Nakanishi研究發(fā)現(xiàn)雞的精子與脂質(zhì)體DNA復(fù)合體混合培養(yǎng)能夠在大多數(shù)精子頭部檢測(cè)到外源DNA，這說(shuō)明雞精子頭部有一定的吸附外源DNA的能力，并且通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些精子具有正常的受精能力和高效率生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚盤(pán)的能力。Squries根據(jù)精子膜的這一特性和相似相溶原理將外源DMA與雞精子共孵育，并且檢測(cè)出了陽(yáng)性表達(dá)。

1.2 胚盤(pán)下腔注射法

剛產(chǎn)出的種蛋中，含有類(lèi)似ES細(xì)胞的干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞，利用顯微注射的方法將各種載體攜帶的外源基因?qū)肱弑P(pán)下腔可以轉(zhuǎn)染，Kwon等通過(guò)胚盤(pán)注射法將表達(dá)EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入129枚雞胚中，孵化21d后獲得13只表達(dá)該外源基因的雛雞。Shinji等通過(guò)胚盤(pán)下腔注射逆轉(zhuǎn)錄莫洛尼鼠白血病病毒導(dǎo)入雞胚中，134個(gè)雞胚其中37個(gè)成功孵化。Petitte等通過(guò)將含隱性白羽性狀雞的胎盤(pán)細(xì)胞注入到含顯性白羽性狀雞的胚下腔中，獲得11.3%的嵌合體胚胎，通過(guò)篩選胎盤(pán)中央?yún)^(qū)細(xì)胞，已將嵌合比率提高到35%，Etches等和Naito都利用這一方法獲得了轉(zhuǎn)基因嵌合體。

1.3 血液注射法

PGCs細(xì)胞在機(jī)體的發(fā)育過(guò)程中具有特殊的運(yùn)行路線，雞的PGCs存在于第X期雞胚的胚盤(pán)下腔中，隨著血的發(fā)育而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中并隨著血液進(jìn)行循環(huán)，在第14至15期時(shí)，血液中的PGCs細(xì)胞達(dá)到高峰，至24期時(shí)，PGCs細(xì)胞開(kāi)始定殖于生殖脊部位，并分化成卵巢中的卵原細(xì)胞或精巢內(nèi)的精原細(xì)胞。根據(jù)這一特性，Masamichi Kamihira等人將逆轉(zhuǎn)錄病毒注射入卵化55h的雞心臟中，并獲得了可在雞血清和雞蛋中高效表達(dá)的scFv-FC，Yoshinori Kawabe等也用相同的方法獲得了轉(zhuǎn)基因的鵪鶉。PGCs轉(zhuǎn)基因法主要針對(duì)生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因，不考慮體細(xì)胞的嵌合問(wèn)題，供體細(xì)胞在形成種系細(xì)胞后能夠進(jìn)一步發(fā)育成攜帶外源基因的功能配子，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和后代篩選有重要意義，但可獲得的PGCs細(xì)胞數(shù)量少，培養(yǎng)條件還不成熟，PGCs轉(zhuǎn)基因操作比較困難，在該技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中有一定的限制性。

1.4 反轉(zhuǎn)錄病毒法

反轉(zhuǎn)錄病毒是依賴(lài)RNA進(jìn)行復(fù)制的RNA病毒，感染宿主細(xì)胞后病毒基因反轉(zhuǎn)錄成DNA，即前病毒DNA，DNA前病毒可以整合到染色體上，從而將所攜帶的外源基因插入到宿主染色體上。反轉(zhuǎn)錄病毒的整合只能發(fā)生在M期，發(fā)生在胚胎發(fā)育的晚期，只有部分細(xì)胞或組織獲得外源基因。Garba等將Mx1基因轉(zhuǎn)至雞細(xì)胞中，使雞獲得了對(duì)禽流感的抗性。Kamaura等用與MDV mRNA互補(bǔ)的一段寡核苷酸轉(zhuǎn)至雞體內(nèi)，也使雞獲得了抗性。

2 Mx基因多態(tài)性與抗流感病毒相關(guān)性研究

Mx基因外顯子上存在多個(gè)突變位點(diǎn)，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，631與2032位點(diǎn)基因突變與雞流感抗病性可能存在一定的相關(guān)性，具有一定的研究和參考價(jià)值。

2002年Ko等[3]通過(guò)分析25個(gè)不同品種雞的Mx蛋白發(fā)現(xiàn)雞的Mx基因呈多態(tài)性分布，通過(guò)與白來(lái)航雞核苷酸序列比較，25個(gè)有差異的們點(diǎn)中有11個(gè)堿基發(fā)生了同義突變，而另外14個(gè)發(fā)生了錯(cuò)義突變，通過(guò)載體轉(zhuǎn)染的方法發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的7個(gè)不同品系的Mx蛋白中只有一部分能抵抗流感病毒和VSV感染。進(jìn)一步比較氨基酸多態(tài)性與Mx蛋白抗病毒活性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)雞Mx蛋白第631位點(diǎn)為天冬酰胺（Asn）時(shí)，該蛋白具有抗流感病毒活性，而表達(dá)為絲氨酸（Ser）時(shí)不能阻止病毒增殖。并且將篩選出來(lái)的基因插入正常正細(xì)胞中，增強(qiáng)其抵抗H5N1型和其他類(lèi)型禽流感病毒的能力，研究還發(fā)現(xiàn)，很多品種的雞體內(nèi)該基因都存在缺陷。

2008年Benfield等[4，5]公布雞Mx基因由14個(gè)外顯子組成，引起631位點(diǎn)多態(tài)性的位點(diǎn)位于最后一個(gè)外顯子上，并且該突變位點(diǎn)多態(tài)性表達(dá)為Asn時(shí)并不能保護(hù)雞抵抗H1N1型病毒感染。

Li等[5]檢測(cè)紅色原雞、15個(gè)中國(guó)地方品種雞和4種商品雞第2032位等位基因A和G的頻率，結(jié)果顯示易感基因G的頻率為0.0446～0.9435，抗生基因A的頻率為0.9554。其中地方品種雞等位基因A的頻率為0.7241～0.9554，顯著高于商品雞（0.0565～0.2742）。

Wu等[6，7]對(duì)15個(gè)不同品種雞的Mx基因2032位進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，檢測(cè)樣品中存在3種基因型（AA、AG、GG），攜帶易感等位基因G和抗性等位基因A的頻率分別為0.650和0.350，其中紅色原雞中等位基因A所占頻率為0.984，顯著高于地方品種（0.321），提示Mx基因2032位呈現(xiàn)多態(tài)性，且原始品種雞的抗病能力較強(qiáng)。

2010年Xiangqun Ye等[8，9]用Real Time等用Real Time PCR的方法對(duì)Mx基因2032位堿基因進(jìn)行了基因分型，對(duì)于采自白來(lái)航雞的97個(gè)血液樣本通過(guò)其溶解曲線進(jìn)行SNP檢測(cè)，此方法對(duì)于傳統(tǒng)PCR具有快速、靈敏、易操作等優(yōu)點(diǎn)。

3 展望

抗病育種在控制疾病方面提供了新的途徑，已在許多領(lǐng)域得到了取得了一定的成就，在家畜家禽抗性基因研究中已經(jīng)篩選了大量的基因，并且與相關(guān)抗病性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)，為人類(lèi)在抗病育種研究方面提供了許多有價(jià)值的參考材料。在禽流感抗病育種研究方面，人們也篩選 出了許多可能存在的與禽流感易感性相關(guān)的基因，特別是對(duì)Mx基因位點(diǎn)的多態(tài)性與抗病性狀的相關(guān)性向我們提示了其作為抗病基因的可能，國(guó)內(nèi)外抗病育種專(zhuān)家也進(jìn)行了越來(lái)越深的研究，為抗禽流感轉(zhuǎn)基因雞的制作提供了很好的參考依據(jù)，為攻克禽流感的流行難題奠定了一定基礎(chǔ)，相信在不久的將來(lái)，隨著基因?qū)爰夹g(shù)、外源基因選擇表達(dá)技術(shù)的深入研究和提高，轉(zhuǎn)基因雞抗禽流感的研究一定能夠以實(shí)質(zhì)性的變化展現(xiàn)在人們面前。

[1] 丁兆忠，苗向陽(yáng)，孫世鐸.抗禽流感病毒轉(zhuǎn)基因雞研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006，33（11）：1-2.

[2] 苷孟侯.禽流感[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995：18-30.

[3] 吳曉偉，范敏其，倪黎綱等.雞Mx基因2032位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2009，45（5）：1-5.

[4] 陳化蘭，于康震，盧景良.禽流感病毒及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].國(guó)外獸醫(yī)學(xué)畜禽傳染病，1997，2（1）：3-7.

[5] Squires EJ，Drake D.Liposome-mediated DNA transfer to chicken sperm cell[J].Mol Reprod Dev，1993，36（2）：258-261.

[6] 崔尚金，陳化蘭，唐秀英，等.禽流感RT-PCR診斷方法的建立[J].中國(guó)畜禽傳染病，1998，20（2）：105-107.

[7] 龐有志，趙淑娟.轉(zhuǎn)基因技術(shù)與雞的抗病育種[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，1999，29（2）：43-44.

[8] 李文雍，陳清軒.mRNA差異顯示技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12（5）：597-601.

[9] Sompayrac L，Jane S，Burn TC，et al.Overcoming limitations of the mRNA differential display technique[J].Nucleic Acids Res，1995，23（22）：4738-4740.