瘋草毒素-苦馬豆素降解菌降解特性的研究

王曉全

(陜西省渭南市澄城縣家畜改良站,陜西渭南 715200)

瘋草毒素-苦馬豆素降解菌降解特性的研究

王曉全

(陜西省渭南市澄城縣家畜改良站,陜西渭南 715200)

從瘋草生長(zhǎng)環(huán)境中的土壤中分離到8株細(xì)菌。其中1號(hào)菌接種量為5%時(shí)可以在12h內(nèi)將含量為50 mg/L的苦馬豆素降解,降解率達(dá)99%以上。降解的最佳溫度為30℃,最佳pH為7,1mol/L的Mg2+可以提高該菌株對(duì)苦馬豆素的降解率;而1mol/L的K+ 對(duì)其降解苦馬豆素有明顯的抑制作用。1g/L的葡萄糖對(duì)其降解有明顯抑制作用。1g/L 淀粉有促進(jìn)作用,乳糖、甘露醇作用不明顯,蔗糖的抑制作用不明顯。降解的速率與苦馬豆素的含量有關(guān),接種細(xì)菌量與降解速率成正相關(guān)。

瘋草;苦馬豆素;生物降解

瘋草（locoweed）是棘豆屬（Oxytropis）和黃芪屬（Astragalus）兩屬植物的統(tǒng)稱，全世界約有2000余種，分布于美國(guó)、俄羅斯、澳大利亞、加拿大、墨西哥、和冰島等國(guó)家。在我國(guó)主要分布于甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆、陜西、四川、寧夏和西藏等?。▍^(qū)）的草原、山地和荒漠，危害、面積超過1100萬平方公頃，占全國(guó)草場(chǎng)面積的2.8%。瘋草具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，對(duì)草原畜牧業(yè)危害大，主要包括：造成牲畜死亡、影響牲畜繁殖、妨礙牲畜改良、促使草場(chǎng)退化等，給草原畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。

苦馬豆素是瘋草的主要有毒成分。國(guó)外獸醫(yī)毒理學(xué)家根據(jù)瘋草對(duì)動(dòng)物毒性作用的不同，將瘋草有毒成分分為三大類：脂肪族硝基化合物、硒及硒化合物、瘋草毒素。探索一條苦馬豆素生物降解的途徑，篩選出能降解苦馬豆素的微生物，研究其對(duì)苦馬豆素的降解特性，深入探討生物降解的分子機(jī)理，并將這些研究成果應(yīng)用于生長(zhǎng)實(shí)踐中。

近年來，應(yīng)用微生物降解毒物、毒素一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，涉及的領(lǐng)域十分廣泛。微生物降解是生物最古老的功能之一，對(duì)物質(zhì)的降解能力上看，其化學(xué)活性幾乎是萬能的，因此自然界中幾乎所有的有機(jī)化合物都可在自然條件下被微生物降解[5]。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)瘋草生長(zhǎng)區(qū)土壤分析，分離篩選出12株能降解瘋草毒素之一四甲基哌啶酮（TMPD）的菌株，建立了微生物降解TMPD的有效方法；其中4株降解率分別達(dá)到82.54%、71.24%、68.20%和66.69%，對(duì)草原毒草的生物學(xué)控制和草原生態(tài)學(xué)研究起到積極作用[4-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

變異黃芪：2000年采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗。土樣：瘋草生長(zhǎng)環(huán)境周圍的土壤。

1.2 方法

1.2.1 苦馬豆素提取

稱取1.5 kg變異黃芪和10 L蒸餾水放在超聲清洗器中浸漬12 h，然后用超聲波50 ℃處理1 h，更換溶媒并在相同條件下重復(fù)1次，收集得水提液加熱濃縮至2 L，除去固體雜質(zhì)，然后在水浴鍋上繼續(xù)濃縮至1 L；加入適量氨水調(diào)pH至8～10，萃取此濃縮液；用稀硫酸萃?。辉儆?～2 L氨性氯仿萃??；濃縮氨性氯仿萃取液得浸膏；最后浸膏在-0.09 MPa 條件下石蠟油浴中進(jìn)行升華。

1.2.2 氣相色譜法檢測(cè)苦馬豆素

將取得的樣品冷凍干燥，每管加145 μl吡啶，80 μl甘露糖甙溶液，25 μl（BSTFA＋TMCS）。反應(yīng)30 min，氣相色譜儀檢測(cè)苦馬豆素含量，收集數(shù)據(jù)計(jì)算降解率。

1.2.3 降解菌的分離

（1）富集選擇培養(yǎng)篩選法

將采于瘋草生長(zhǎng)環(huán)境的土樣作為篩選菌株的來源，進(jìn)行降解菌的篩選。將土樣用無菌水制成菌懸液，以10%的接種量接種于富集培養(yǎng)夜，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48h后，按10%的接種量接種于含SW 30 mg/L的富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2 d后再以10%接種量接種于新鮮的含SW50 mg/L的富集培養(yǎng)液中，以后每隔4 d移種一次，并逐漸增加SW含量，當(dāng)SW濃度為200 mg/L時(shí)，對(duì)長(zhǎng)出的菌落用平板劃線法進(jìn)行分離純化。

（2）平板分離

挑取生長(zhǎng)在SW為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上的菌落，涂布于牛肉蛋白胨平板，反復(fù)劃線純化，保存于4 ℃。

1.2.4 不同外界條件對(duì)降解菌降解能力的影響

（1）不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解能力的影響

以5%的接種量將1號(hào)菌接種到含有50 mg/L苦馬豆素的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，搖動(dòng)培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌的SW無機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，每隔2 h取樣。將樣品凍干后用氣相測(cè)定法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

（2）不同pH對(duì)降解能力的影響

以5%的接種量將1號(hào)菌接入到不同pH的含50mg/L苦馬豆素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌的SW無機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，每隔3 h取樣。將樣品凍干后用氣相測(cè)定法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

（3）不同溫度對(duì)降解能力的影響

以5%的接種量將1號(hào)菌接入到含有50 mg/L苦馬豆素的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中分別20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌的SW無機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，每隔2 h取次樣。將樣品凍干后用氣相測(cè)定法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

（4）苦馬豆素初始濃度對(duì)降解的影響

分別在含0.5%、1%、5%、10%、20%苦馬豆素的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入1號(hào)菌使其含量為50 mg/L，30℃，2 h取樣一次。將樣品凍干后用氣相測(cè)定法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

（5）不同接菌量對(duì)降解能力的影響

以5%的接種量將1號(hào)菌接入到含有200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、30 mg/L、10 mg/L苦馬豆素的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌的SW無機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，2 h取樣一次。將樣品凍干后用氣相色譜法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

（6）金屬離子對(duì)降解能力的影響

分別在含5%1號(hào)菌和50 mg/L苦馬豆素的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入MgSO4、KNO3使離子濃度為1 mol/L，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌的SW無機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，將樣品凍干后用氣相測(cè)定法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

（7）其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)降解的影響

將葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇加入到含50 mg/L苦馬豆素中使這些物質(zhì)含量為10 g/L，搖床培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌的SW無機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，每3h取樣一次。將樣品凍干后用氣相測(cè)定法測(cè)定苦馬豆素的含量，計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離

按照1.2.2方法共分離出8株菌其中1號(hào)菌可以對(duì)苦馬豆素進(jìn)行很好的降解。

2.2 不同時(shí)間培養(yǎng)對(duì)降解能力的影響

按1.2.4（1）的方法，苦馬豆素在12個(gè)小時(shí)內(nèi)已被完全已經(jīng)完全降解。

2.3 pH對(duì)降解能力的影響

按1.2.4（2）的方法，pH7為苦馬豆素降解的最佳pH，堿性條件優(yōu)于酸性條件。

2.4 不同溫度對(duì)降解能力的影響

按1.2.4（3）的方法，降解的最佳的溫度為30℃。

2.5 苦馬豆素初始濃度對(duì)降解的影響

按1.2.4（4）的方法，苦馬豆素的初始濃度越低降解完所用時(shí)間越短，苦馬豆素初始濃度越高降解完所用時(shí)間越長(zhǎng)。

2.6 不同接菌量對(duì)降解能力的影響

按1.2.4（5）的方法，1號(hào)菌的接種量與降解率成正相關(guān)。

2.7 金屬離子對(duì)降解能力的影響

按1.2.4（6）的方法1mol/L k+降解有抑制作用，1mol/L mg2+對(duì)降解有促進(jìn)作用。

2.8 其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)降解的影響

按1.2.4（7）的中的方法，1號(hào)菌在降解苦馬豆素時(shí)加入葡萄糖對(duì)其降解有抑制作用且較為明顯。而淀粉有促進(jìn)作用乳糖、甘露醇作用不明顯，蔗糖有抑制作用但不明顯。

3 結(jié)論

從瘋草生長(zhǎng)環(huán)境周圍的的土壤中分離出來的8株菌中的1號(hào)菌在溫度30℃、pH7情況下降解苦馬豆素效果最佳；苦馬豆素的初始濃度越高降解越慢，越低降解越快；1號(hào)菌的種量與降解速率成正相關(guān)；金屬離子的存在對(duì)降解影響較大，1mol/L k+降解有抑制作用，1mol/L mg2+對(duì)降解有促進(jìn)作用；低濃度其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)降解有影響，葡萄糖對(duì)其降解有抑制作用且較為明顯。而淀粉有促進(jìn)作用乳糖、甘露醇作用不明顯，蔗糖有抑制作用但不明顯。

[1] 李柞煌，關(guān)亞農(nóng)，楊桂云，等.醉馬草（小花棘豆）中毒的調(diào)查和有毒成分的研究[J].內(nèi)蒙古畜牧獸醫(yī)，1978，（1）：1-18.

[2] 李建科，楊具田，潘和平，等.家畜黃花棘豆、甘肅棘豆中毒的調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，1987，（5）：22-23.

[3] 王建華，張志恒，高巨星.西藏阿里地區(qū)動(dòng)物“醉馬草”中毒病調(diào)查報(bào)告[J].動(dòng)物毒物學(xué)，1998，13（1-2）：22-27.

[4] 李勤凡.冰川棘豆的毒性及降解菌的研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[5] 張浩，劉緒川.瘋草中毒研究概況及其進(jìn)展[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)研究所，730050.