血凝-血凝抑制試驗質(zhì)量控制及異常結(jié)果成因分析

楊翠玲（濰坊市經(jīng)濟(jì)學(xué)校 山東 諸城 262200）

血凝-血凝抑制試驗在基層比較常用，該方法操作簡單，但是有許多因素可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。筆者根據(jù)多年的實驗室操作經(jīng)驗，提出本試驗的質(zhì)量控制要點，并分析試驗操作中常見異常結(jié)果成因。

血凝-血凝抑制試驗方法敏感性高、特異性強(qiáng)、速度快、成本低及操作方便，因此廣泛用于新城疫、禽流感等疾病的流行病學(xué)調(diào)查、疫病診斷、免疫監(jiān)測等工作中，但其結(jié)果受實驗材料、操作技術(shù)的影響較大。

1 質(zhì)量控制

1.1 器材的選擇及使用

1.1.1 微量反應(yīng)板 應(yīng)選擇V型反應(yīng)板，分為一次性及重復(fù)使用兩種。重復(fù)使用應(yīng)遵循反復(fù)沖洗、2～3%的鹽酸浸泡過夜、蒸餾水反復(fù)沖洗、晾干程序；切忌煮沸消毒、高壓滅菌及試管刷刷洗，以免變形及破壞光滑性。

1.1.2 吸頭 有條件的單位最好選用新的，防止因磨損造成吸液不準(zhǔn)確；若需重復(fù)使用，應(yīng)經(jīng)超聲波清洗、高壓滅菌后方可使用，并及時更新。

1.1.3 移液器 移液器應(yīng)定期校準(zhǔn)并遵循使用規(guī)范，注意：（1）在整個試驗中，最好使用同一移液器以減小誤差；（2）稀釋液體時，要垂直插入，不可過深，反復(fù)吹打6～8次，確?；靹?；（3）滴加四單位抗原時，最好懸空并防止液體濺出。

1.2 主要試劑

1.2.1 稀釋液 常用稀釋液是生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)或PBS，按要求配制后，調(diào)整pH值為7.0～7.2并高壓滅菌[1]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)抗原、血清 新購入抗原要檢測其血凝價，如果與所標(biāo)抗原價不符，應(yīng)重新檢測?？乖?、血清要分裝，-20℃保存，試驗前將抗原、血清取出，使其完全融化。

1.2.3 待檢血清 分離的待檢血清可于4℃的冰箱保存5d[2]， 時間若超過1周，需冰凍保存。檢測凍結(jié)血清時，溶化后可采用上下顛倒的方式混勻，以防形成氣泡及蛋白質(zhì)變性。在使用中，應(yīng)避免反復(fù)凍融，以不超過3～5個周期為宜。

1.3 試驗操作

1.3.1 1%紅細(xì)胞配制 最好采集同種3只以上非免疫公雞的血液混合制作紅細(xì)胞，以減少非特異性凝集現(xiàn)象。若是免疫過的雞，需增加洗滌次數(shù)。特別注意：（1）吸取紅細(xì)胞壓積時要伸到底部，確保紅細(xì)胞濃度正確。（2）加紅細(xì)胞前，要搖勻，邊搖邊加，確保紅細(xì)胞濃度一致；并且低濃度孔向高濃度孔加，以減少污染；（3）做同一次試驗或測同一批樣品時，不能更換紅細(xì)胞，以免對結(jié)果判定造成影響。

1.3.2 四單位抗原的配制 HA試驗時，建議同時進(jìn)行至少3排抗原滴度的測定，確?？乖r準(zhǔn)確。注意：（1）配制后須作回歸試驗。若過高或過低，都應(yīng)反復(fù)校準(zhǔn)后才能用于HI試驗；（2）做同一次試驗或測同一批樣品時，不能更換四單位抗原；（2）最好現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫下不可超過4h，4℃可保存1d，如時間過久，需重新檢測HA效價；（3）滴加抗原時，要充分搖勻，確保每一孔濃度一致。

1.3.3 感作條件 孵育溫度對試驗的影響較大，在4～37℃范圍內(nèi)，感作溫度直接影響著反應(yīng)時間，應(yīng)按照國家標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格控制在室溫(20～25℃)，30～40m in判定結(jié)果；另外抗原抗體反應(yīng)時間對結(jié)果影響較大，應(yīng)控制在室溫，感作20m in為宜，直到對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果[4]。

1.3.4 結(jié)果判定 結(jié)果判定應(yīng)以對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果為依據(jù)，將微量反應(yīng)板傾斜，以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒的血凝價，即HA效價；判定血清抗體滴度時，以100%抑制病毒凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度，即HI效價。

2 常見異常結(jié)果成因分析

2.1 對照孔凝集

（1）血凝試驗中稀釋液對照孔的紅細(xì)胞如出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，可能原因：稀釋液中的氯化鈉濃度過高或者被細(xì)菌污染；紅細(xì)胞被細(xì)菌污染或保存時間過長。（2）血凝抑制試驗中血清對照孔應(yīng)完全沉淀，如出現(xiàn)凝集現(xiàn)象除以上原因外，還可能與以下因素有關(guān)：血清變質(zhì)或被細(xì)菌污染；抗原血凝價測定得不準(zhǔn)確導(dǎo)致作抗原濃度過高[5]。

2.2 全部凝集

產(chǎn)生此種現(xiàn)象除稀釋液對照孔凝集所述因素外，還可能與四單位抗原配制過高、紅細(xì)胞配制濃度過低有關(guān)[1]。

2.3 抗原對照孔沉淀

血凝抑制試驗中四單位抗原對照孔如果出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，可能是因為抗原血凝效價測定不準(zhǔn)確，導(dǎo)致四單位抗原過低，不足以凝集紅細(xì)胞。

2.4 淚滴狀流淌(完全血凝抑制)線細(xì)

一般是由于溫度低或作用時間短，結(jié)果還沒有完全顯示，需靜置一段時間后再讀數(shù)；也有可能紅細(xì)胞濃度過低引起。

2.5 結(jié)果出現(xiàn)慢

20～25 ℃時，感作20～30min即可判定效價。當(dāng)溫度低于15℃時，往往需要超過40m in才能出現(xiàn)清晰的結(jié)果。

2.6 結(jié)果出現(xiàn)快，并且整板無凝集現(xiàn)象

（1）超過30℃時，試驗結(jié)果出現(xiàn)快，20min左右就可讀數(shù)。時問過長，結(jié)果就會消失，使整板無凝集現(xiàn)象，誤判為抗原效價為0或者抗體效價為12 log2。（2）血凝-血凝抑制試驗操作雖然簡單，但是影響結(jié)果的因素較多，實際操作時應(yīng)注意規(guī)范操作，同時應(yīng)對異常試驗結(jié)果進(jìn)行分析，分析其成因，消除不利因素，減少試驗誤差，確保試驗質(zhì)量。

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[2]王彥數(shù),張芳.血凝與血凝抑制試驗操作要領(lǐng)[J].中國動物保健,2009,8:75-76.

[3]黃文忠.雞新城疫血凝抑制試驗(HI)的影響因素[J].中國家禽,2000,22(5)::29-30.

[4]張波,閻紅,莊艷.實驗室操作過程中影響血凝抑制試驗的因素[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2006,10:44-45.

[5]史玉梅,胡瑛瑛,韓明香.影響血凝抑制試驗的因素[J].黑龍江動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué),2005,4:78-79.

[6]靳艷玲,羅薇,于學(xué)輝.血凝及血凝抑制試驗的應(yīng)用[J].西南民族大學(xué)學(xué)報,2005,3:90-92.