PCR-線性雜交酶顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性效果分析

李大登，馬俊，魏小妹(江陵縣人民醫(yī)院，湖北江陵43400;武漢市醫(yī)療救治中心)

PCR-線性雜交酶顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性效果分析

李大登1，馬俊2，魏小妹1
(1江陵縣人民醫(yī)院，湖北江陵434100;2武漢市醫(yī)療救治中心)

摘要:目的探討PCR-線性雜交酶顯色法(以下稱顯色法)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼及利福平耐藥性的臨床價(jià)值。方法選擇結(jié)核病患者的臨床痰標(biāo)本471份，其中結(jié)核分枝桿菌分離株120株(分離株)、痰涂陽(yáng)性標(biāo)本351份(痰涂標(biāo)本)。采用顯色法對(duì)兩種標(biāo)本行異煙肼及利福平耐藥性檢測(cè)，以傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法所用的檢測(cè)時(shí)間，分析顯色法檢測(cè)的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。結(jié)果顯色法對(duì)分離株及痰涂標(biāo)本耐藥性的檢測(cè)時(shí)間均少于比例法(P＜0.01)。顯色法檢測(cè)分離株中異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值分別為93.33%、100%、100%及97.83%，利福平分別為90.91%、100%、100%及98%;痰涂陽(yáng)性標(biāo)本中異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值分別為83.33%、97.97%、88.24% 及97%，利福平分別為89.66%、97.27%、86.67及97.94。結(jié)論顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、利福平耐藥的靈敏性和特異性均較高，可在24 h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，是一種快速、可靠檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥的方法。

關(guān)鍵詞:線性雜交酶顯色法;結(jié)核分枝桿菌;異煙肼;利福平;抗藥性

異煙肼及利福平是治療結(jié)核的一線藥物，結(jié)核分枝桿菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥是影響結(jié)核病治療效果的主要原因［1］。傳統(tǒng)的藥物敏感試驗(yàn)采用比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，易延誤治療時(shí)間。PCR-線性雜交酶顯色法(GenoType?MTBDRplus法，以下稱顯色法)是一種快速、可靠的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法［2，3］。2011年7月～2014年5月，我們采用顯色法檢測(cè)了肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼及利福平的耐藥情況，探討該方法在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇同期就診于武漢市醫(yī)療救治中心的疑似肺結(jié)核病患者［男295例、女255例，年齡14～83(47±6.43)歲］的臨床痰標(biāo)本471例份，其中結(jié)核分枝桿菌分離株(以下稱分離株) 120株，痰涂陽(yáng)性(金銨“O”染色陽(yáng)性)標(biāo)本351例份(以下稱痰涂標(biāo)本)。

1.2耐藥性檢測(cè)對(duì)所有標(biāo)本分別采用顯色法及比例法藥敏試驗(yàn)行異煙肼和利福平耐藥性檢測(cè)。

1.2.1顯色法嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行，主要分為4步:超聲波水浴破菌提取DNA、對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交顯色、結(jié)果判讀。如試紙條上所有的野生型條帶顯色而突變型條帶不顯色，則將該菌株判定為敏感株。如對(duì)應(yīng)藥物的野生型條帶不顯色或突變型條帶顯色，則將該菌株判定為耐藥菌株。如試紙條上TUB質(zhì)控帶為陰性，表示所試細(xì)菌不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，需排除。

1.2.2比例法嚴(yán)格按常規(guī)步驟操作，主要分為4 步:菌懸液制備、菌液稀釋、接種培養(yǎng)、報(bào)告結(jié)果。如耐藥百分比大于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

1.3檢測(cè)效果分析比較兩種方法所用的檢測(cè)時(shí)間。以比例法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用交叉列表對(duì)比法，分析顯色法檢測(cè)異煙肼及利福平耐藥性的檢測(cè)效果，靈敏性=(真耐藥數(shù)+假敏感數(shù))/真耐藥數(shù)×100%，特異性=(真敏感數(shù)+假耐藥數(shù))/真敏感數(shù)×100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=(真耐藥數(shù)+假耐藥數(shù))/真耐藥數(shù)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=(真敏感數(shù)+假敏感數(shù))/真敏感數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1檢測(cè)時(shí)間顯色法對(duì)分離株與痰涂標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間分別為(6.12±1.23)、(6.24±1.32) h，比例法分別為(2.12±0.64)、(4.03±2.13)個(gè)月，顯色法對(duì)分離株及痰涂標(biāo)本耐藥性的檢測(cè)時(shí)間均少于比例法(P＜0.01)。

2.2分離株耐藥性顯色法檢測(cè)出對(duì)異煙肼耐藥28株、利福平耐藥20株，比例法分別為30、22株，顯色法檢測(cè)分離株對(duì)異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為93.33% (28/30)、100%(90/90)、100% (28/28)及97.83% (90/92)，利福平分別為90.91% (20/22)、100% (98/98)、100%(20/20)及98%(98/100)。

2.3痰涂標(biāo)本耐藥性顯色法檢測(cè)出對(duì)異煙肼耐藥45例份、利福平耐藥52例份，比例法分別為54、58例份。顯色法檢測(cè)痰涂標(biāo)本對(duì)異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為83.33%(45/54)、97.97% (291/300)、88.24% (45/51)及97%(291/300)，利福平分別為89.66% (52/58)、97.27% (285/293 )、86.67% (52/60 )及97.94%(285/291)。

3　討論

目前，結(jié)核分枝桿菌耐藥性已成為導(dǎo)致結(jié)核病疫情上升及病情難以控制的一個(gè)重要原因［4～6］。異煙肼與利福平是一線抗結(jié)核治療的主要藥物，臨床應(yīng)用較為普遍，因此兩藥的耐藥性較常見，耐藥率也較高［7～9］。研究發(fā)現(xiàn)，約30%的結(jié)核病患者對(duì)異煙肼與利福平耐藥，可能與臨床對(duì)以異煙肼及利福平為主的短程化療方案的過(guò)度濫用有關(guān)［10］。因此，為更好地應(yīng)用異煙肼與利福平、降低結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，應(yīng)采用快速、有效的耐藥性檢測(cè)技術(shù)以早期發(fā)現(xiàn)耐藥性。

比例法是WHO推薦的藥敏試驗(yàn)方法，是臨床判斷結(jié)核分枝桿菌是否耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)。但該方法檢測(cè)步驟較多、檢測(cè)人員工作量大，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，一般需2～4個(gè)月，導(dǎo)致在檢測(cè)期間選擇臨床用藥時(shí)無(wú)法及時(shí)調(diào)整治療方案，可能延誤結(jié)核病的治療。顯色法是基于PCR-線性探針雜交原理檢測(cè)耐藥基因的檢測(cè)技術(shù)［11～14］，可通過(guò)檢測(cè)對(duì)利福平耐藥的rpoB基因和對(duì)異煙肼耐藥的katG、inhA基因是否突變判斷結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，可在24 h內(nèi)完成耐藥性檢測(cè)。采用顯色法可直接從涂陽(yáng)痰標(biāo)本及分離株中檢測(cè)耐藥基因，節(jié)省了分離培養(yǎng)的時(shí)間，使檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告時(shí)間比比例法縮短了2～4周。本研究發(fā)現(xiàn)，顯色法6 h左右即可報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，而比例法則需要2～4個(gè)月，表明顯色法可以更早地獲得耐藥性檢測(cè)結(jié)果，有利于臨床及時(shí)調(diào)整用藥。采用顯色法檢測(cè)分離株異煙肼、利福平耐藥性的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值均較高，對(duì)痰涂標(biāo)本檢測(cè)的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值亦較高但均低于分離株。

綜上所述，顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、利福平耐藥的靈敏性和特異性均較高，可在24 h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性快速、有效的方法。

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(收稿日期:2014-10-20)

文章編號(hào):1002-266X(2015) 18-0075-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R978.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.028