miR-93轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901侵襲遷移能力的影響及機(jī)制探討

趙立剛，姜維民，董茂盛

(中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京100088)

摘要：目的觀察上調(diào)miR-93表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901侵襲遷移能力的影響，并探討其可能機(jī)制。方法將miR-93模擬物及其陰性對(duì)照物分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的miR-93，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移及侵襲能力，qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5(CHD5)mRNA和蛋白。結(jié)果與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照物的SGC-7901細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-93模擬物的SGC-7901細(xì)胞miR-93表達(dá)明顯增加(P<0.01)、遷移和侵襲能力增強(qiáng)(P均<0.05)、CHD5 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論 過(guò)表達(dá)miR-93可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能與CHD5表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：微小RNA；微小RNA93；胃癌；胃癌細(xì)胞株SGC-7901；染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5；癌細(xì)胞遷移；癌細(xì)胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.011

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-08-24)

通信作者：董茂盛

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，病死率占我國(guó)腫瘤相關(guān)死亡率的第4位[1]，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因。因此，尋找一種特有的、能夠早期阻斷胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的靶向分子，對(duì)于胃癌的治療具有重要意義。microRNAs(miRNAs) 是一類(lèi)非編碼單鏈RNA，包含19～25個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合而抑制靶基因的翻譯，影響其蛋白表達(dá)，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[2]。過(guò)表達(dá)miR-93能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞[3]、鼻咽癌細(xì)胞[4]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞[5]的增殖及遷移。染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5 (CHD5)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，CHD5在肝細(xì)胞肝癌[6]、胰腺癌[7]、膽囊癌[8]等多種腫瘤組織中呈低表達(dá)甚至表達(dá)缺失，提示CHD5在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起到了重要作用。2015年5月10日～6月31日，我們將miR-93模擬物(miR-93mimics)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力、CHD5 mRNA及蛋白，觀察過(guò)表達(dá)miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。主要試劑：DMEM及Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco, 美國(guó))，胎牛血清、LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美國(guó))，CHD5兔抗人單克隆抗體及山羊抗兔二抗、α-Tubulin鼠抗人單克隆抗體及山羊抗鼠二抗(Santa Cruz, 美國(guó))；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京天根)，miR-93 mimics及陰性對(duì)照、RNA提取試劑TRIzol、 qRT-PCR探針及引物試劑盒(蘇州吉瑪)，Transwell小室(Corning，美國(guó))，Matrigel基質(zhì)膠(BD，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及miR-93轉(zhuǎn)染將SGC-7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、95% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3～4 d換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板并分為兩組，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染：miR-93 mimics轉(zhuǎn)染組(SGC-7901-miR-93組)加入LipofectamineTM2000、Opti-MEM及miR-93 mimics(終濃度100 nmol/L)；轉(zhuǎn)染miR-93陰性對(duì)照物的陰性對(duì)照組(SGC-7901-NC組)加入LipofectamineTM3000、Opti-MEM及miR-93陰性對(duì)照質(zhì)粒(終濃度100 nmol/L)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞均在在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2SGC-7901細(xì)胞miR-93檢測(cè)采用qRT-PCR。分別收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組細(xì)胞，用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA。qRT-PCR套裝試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性12 s，62 ℃退火延伸35 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參。引物序列：miR-93上游引物為5′-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3′,下游引物為5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′；U6上游引物為5′-GCACCCGTCCAAGAGAGTC-3′，下游引物為5′-GGTTCCATCCGTACAGCCT-3′。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。miR-93相對(duì)表達(dá)量用ΔCt表示，升降倍數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCtSGC-7901-miR-93組-ΔCtSGC-7901-NC組。

1.2.3SGC-7901細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)采用Transwell實(shí)驗(yàn)。Matrige1膠用預(yù)冷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基1∶1稀釋后，均勻涂于8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的Transwell小室內(nèi)，37 ℃靜置30 min。收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組SGC-7901細(xì)胞。分別于Transwell小室的上室接種無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸的兩組SGC-7901細(xì)胞(1×105/mL)懸液200 μL，下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基800 μL；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transuell小室，用棉簽輕輕擦去小室底部未穿過(guò)基底膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)，每個(gè)小室隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4兩組SGC-7901細(xì)胞遷移能力檢測(cè)采用劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組同前，首先于6孔板背側(cè)每隔0.5 cm用Mark筆劃一橫線，橫穿過(guò)孔，每孔至少劃5條線。兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，用微量槍頭(200 μL)垂直6孔板背側(cè)的橫線劃痕。PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48 h后取樣拍照，采用Image J 測(cè)量細(xì)胞覆蓋率，以比較細(xì)胞遷移的速度。

1.2.5SGC-7901細(xì)胞CHD5 mRNA及蛋白檢測(cè)①CHD5 mRNA檢測(cè)：采用qRT-PCR。分別收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組SGC-7901細(xì)胞，用TRIzol抽提各組細(xì)胞總RNA。qRT-PCR套裝試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃變性12 s，62 ℃退火延伸35 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參。引物序列：CHD5上游引物為5′-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC-3′，下游引物為5′-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG-3′；β-actin上游引物為5′-CGTGGACATCCGCAAAGA -3′，下游引物為5′-GAAGGTGGACAGCGAGGC-3′。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。CHD5 mRNA相對(duì)表達(dá)量用ΔCt表示，升降倍數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCtSGC-7901-miR-93組-ΔCtSGC-7901-NC組。②CHD5蛋白檢測(cè)：采用Western blotting。分別收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組SGC-7901細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，各取50 μg蛋白上樣,10%的SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，用抗CHD5抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，以α-Tubuli作為內(nèi)參，再用相應(yīng)的二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，PBST洗膜10 min×3 次，配置新鮮發(fā)光液，將膜孵育3min，暗室X線片曝光1-5 min，顯影1 min，定影30 s成像。采用Image lab檢測(cè)條帶灰度值，以此表示CHD5蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1兩組SGC-7901細(xì)胞的miR-93表達(dá)比較SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組SGC-7901細(xì)胞的miR-93相對(duì)表達(dá)量分別為5.37±0.43、9.01±0.61；與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細(xì)胞的miR-93表達(dá)上調(diào)11.34±2.23倍，兩組相比，P<0.01。

2.2兩組SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力比較SGC-7901-miR93組穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)為(99.76±10.41)個(gè)/HP，SGC-7901-NC組穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)為(56.38±7.82)個(gè)/HP，兩組相比，P<0.05。

2.3兩組SGC-7901細(xì)胞的遷移能力比較SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組細(xì)胞覆蓋率分別為82.63%±9.14%、48.71%±5.28%，與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細(xì)胞的遷移能力提高了43.51%，兩組相比，P<0.05。

2.4 兩組SGC-7901細(xì)胞CHD5 mRNA及蛋白表達(dá)比較SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組CHD5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為10.01±1.02、9.24±0.89，與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細(xì)胞CHD5 mRNA的表達(dá)下降了0.39±0.05倍，兩組相比，P<0.05。SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組CHD5蛋白表達(dá)量分別為0.46±0.06、0.25±0.04；與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細(xì)胞CHD5蛋白表達(dá)下降了48.77%，兩組相比，P<0.05。

3討論

miRNAs主要通過(guò)與靶基因3′端非翻譯區(qū)完全或不完全互補(bǔ)來(lái)降解靶基因或抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡及增殖等一系列生命活動(dòng)過(guò)程[9]。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a在胃癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-29a能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。提示miR-29a在胃癌中起著抑癌基因的作用。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-107在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織及正常肝細(xì)胞，且過(guò)表達(dá)miR-107能促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞增殖，提示miR-107在肝癌中發(fā)揮著癌基因的作用。目前，胃癌的miRNA研究主要應(yīng)用于胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物、分子靶向治療靶點(diǎn)、腫瘤的耐藥性及疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)等方面[12]。Fu等[13]利用qRT-PCR方法檢測(cè)胃癌、慢性萎縮性胃炎及健康人群血清中的miR-222，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中miR-222表達(dá)量明顯升高，ROC曲線顯示其敏感度66.1%、特異性為88.3%，且Kaplan-Meier生存分析提示血清中miR-222表達(dá)量越高的患者，其無(wú)病生存率及總生存率越低。Chen等[14]利用qRT-PCR方法檢測(cè)158例胃癌組織和癌旁正常組織中的miR-93，發(fā)現(xiàn)128例胃癌組織中miR-93的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，且miR-93的表達(dá)與腫瘤的分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著相關(guān)，癌組織中miR-93高表達(dá)的患者總生存期及無(wú)病生存期均顯著短于低表達(dá)者。提示miR-93在胃癌中發(fā)揮著癌基因的作用。本研究采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR-93 mimics以上調(diào)miR-93的表達(dá),結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-93能顯著增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞的遷移及侵襲能力。這一結(jié)果提示miR-93在胃癌中可能發(fā)揮著類(lèi)似癌基因的作用。

為了進(jìn)一步研究miR-93的功能及其在胃癌中的可能作用機(jī)制，我們檢索了microRNA.org等生物信息學(xué)網(wǎng)站，預(yù)測(cè)CHD5可能是miR-93的靶基因。CHD5是CHD蛋白家族的第5個(gè)成員，是2007年由Bagchi等采用染色體基因工程技術(shù)首次證實(shí)的一種抑癌基因，CHD5通過(guò)調(diào)控p19arf/p53通路以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，還可以調(diào)節(jié)ras基因而抑制正常細(xì)胞發(fā)生惡變[15]。CHD5在多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)甚至表達(dá)缺失，包括乳腺癌[16]、肺癌[17]及結(jié)直腸癌[18]等。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CHD5基因在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，在胃癌的7種細(xì)胞系中CHD5基因同樣出現(xiàn)低表達(dá)甚至表達(dá)沉默；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CHD5能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，證實(shí)了CHD5在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著抑癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后，其CHD5 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低。因此，推測(cè)miR-93可能通過(guò)靶向抑制CHD5的表達(dá)在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用。

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