陳俊杰，鄭娜芬，葉梓瑩，林俊汕，區(qū)瑞章，曾宇婷

(1增城市人民醫(yī)院，廣東增城511300；2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院)

miR-137基因轉(zhuǎn)染對人眼葡萄膜黑色素瘤細胞侵襲能力的影響及機制

陳俊杰1，鄭娜芬2，葉梓瑩2，林俊汕2，區(qū)瑞章2，曾宇婷2

(1增城市人民醫(yī)院，廣東增城511300；2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院)

目的 探討miR-137基因轉(zhuǎn)染對人眼葡萄膜黑色素瘤細胞系M23細胞侵襲能力的影響及其機制。方法 將正常培養(yǎng)的M23細胞分為轉(zhuǎn)染組和對照組，每組3孔，分別采用LipofectamineTM2000 瞬時轉(zhuǎn)染miR-137 mimic及miR-137 mimics 陰性對照。轉(zhuǎn)染18 h后用Transwell侵襲試驗檢測兩組細胞侵襲能力(穿膜細胞數(shù))；48 h后采用Western blot法檢測細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9水平。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組穿膜細胞數(shù)明顯少于對照組(P均<0.05)； MMP-2和MMP-9蛋白表達低于對照組(P均<0.05)；細胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9水平低于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 miR-137基因轉(zhuǎn)染對M23細胞的侵襲能力有抑制作用；其機制可能為抑制細胞MMP-2和MMP-9表達。

葡萄膜黑色素瘤；侵襲；miR-137基因；基質(zhì)金屬蛋白酶

葡萄膜黑色素瘤是最常見的成人眼內(nèi)惡性腫瘤，具有非常高的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[1,2]。但對其發(fā)病機制的研究較少[3]。葡萄膜黑色素瘤具有極高的血行轉(zhuǎn)移概率，其中以肝轉(zhuǎn)移最常見，約占了全部轉(zhuǎn)移的90%以上，病死率很高[4]。微小RNA(miRNA)近年來成為生命科學特別腫瘤領(lǐng)域研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在人眼葡萄膜黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[5,6]。我們前期研究顯示上調(diào)miR-137表達能抑制人眼葡萄膜黑色素瘤細胞系M23的增殖和遷移能力[7]。2014年1～7月，我們觀察了miR-137基因轉(zhuǎn)染對人葡萄膜黑色素瘤M23細胞侵襲能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人眼葡萄膜黑色素瘤細胞系M23購自ATCC；miR-137 mimics及對應(yīng)的miR-137 mimics 陰性對照由上海吉瑪公司設(shè)計并合成；熒光標記的隨機序列RNA由美國Ambion公司合成；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；Opti-MEM培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；8.0 μm孔徑PC膜Transwell小室購自美國Corning公司；細胞外基質(zhì)(ECM)膠購自美國Sigma公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基(無酚紅)購自北京寰宇科創(chuàng)生物科技公司；MMP-2和MMP-9 ELISA檢測試劑盒、辣根酶標記抗兔IgG購自武漢博士德生物；兔抗MMP-2及MMP-9單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology； SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL反應(yīng)檢測試劑盒和總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白濃度檢測試劑盒購自南京凱基公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期M23細胞胰酶消化制成細胞懸液，接種于6孔板，每孔3.5×105個細胞，接種后20 h細胞生長良好時分為轉(zhuǎn)染組和對照組，每組3個復(fù)孔；分別通過LipofectamineTM2000采用miR-137 mimics、miR-137 mimics 陰性對照組瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度均為30 nmol/L。同時轉(zhuǎn)染熒光標記的隨機序列RNA以觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染方法按照minR-137 mimics說明書操作。

1.2.2 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲試驗。Transwell小室上室面鋪上ECM膠制備Transwell侵襲模型小室。兩組轉(zhuǎn)染18 h時胰酶消化制備成細胞懸液，細胞濃度調(diào)整為2×105/mL，上室加入細胞懸液200 μL，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基500 μL，置37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱。30 h后取出小室，甲醇固定后蘇木素將膜浸泡染色，顯微鏡下觀察膜的下室面，隨機選取10個200倍視野計數(shù)每個孔穿過膜的細胞數(shù)量(穿膜細胞數(shù))。

1.2.3 MMP-2、MMP-9蛋白表達檢測 ①細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達：采用Western blot法。轉(zhuǎn)染48 h收集兩組細胞，按照全蛋白提取試劑盒說明書操作提取蛋白，采用蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，每條泳道加40 μg蛋白進行等質(zhì)量上樣，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，一抗MMP-2和MMP-9以1∶1 000稀釋使用，4 ℃孵育過夜，二抗IgG(稀釋度1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后ECL化學發(fā)光法檢測，GAPDH為內(nèi)對照。顯像圖用Image J 軟件進行分析。用軟件讀取各條帶灰度值，然后將各組待檢測蛋白條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)對照條帶灰度值進行相比，即為相對蛋白表達量。②細胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9蛋白水平：采用ELISA法。細胞轉(zhuǎn)染后18 h換液，改用不含血清的無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 h后離心收集上清，按ELISA檢測說明書檢測分泌型MMP-2和MMP-9含量, 重復(fù)3次。相對表達量按照說明書進行計算。

2 結(jié)果

將熒光標記的隨機序列RNA 轉(zhuǎn)染M23細胞，24 h在熒光顯微鏡下觀察，基本上所有細胞均有熒光顯示，說明轉(zhuǎn)染效率接近100%。

2.1 細胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染組、對照組穿膜細胞數(shù)分別為(30.25±8.71)、(103.38±11.69)個，轉(zhuǎn)染組明顯少于對照組(P<0.05)。

2.2 細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達 轉(zhuǎn)染組MMP2和MMP-9蛋白相對表達量分別為0.157±0.033和0.208±0.051，對照組分別為0.892±0.040和0.969±0.032，轉(zhuǎn)染組均低于對照組(P均<0.05)。

2.3 細胞上清液中MMP-2、MMP-9水平 轉(zhuǎn)染組細胞上清液中MMP-2和MMP-9表達量分別為0.663±0.033和0.854±0.059，對照組分別為1.618±0.021和1.730±0.084，轉(zhuǎn)染組均低于對照組(P均<0.05)。

3 討論

人眼葡萄膜黑色素瘤是成人最常見的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，其除皮膚外第二常見的原發(fā)性惡性黑素瘤[8]。葡萄膜黑色素瘤具有極高的轉(zhuǎn)移能力，大多數(shù)患者在診斷時往往已發(fā)生亞臨床轉(zhuǎn)移[9]。迄今為止，葡萄膜黑色素瘤的病因尚未被闡明，臨床上對其缺乏有效治療方法，且治療標準尚未統(tǒng)一。由于葡萄膜黑色素瘤生長和播散的機制不明，對發(fā)生轉(zhuǎn)移的葡萄膜黑色素瘤更加缺乏有效的治療手段[10]。探討葡萄膜黑色素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制，尋求新的治療靶點，對葡萄膜黑色素瘤的防治具有重大意義。

miR-137在多種物種間具有高度保守性，已證實在多種腫瘤組織中其表達減低，扮演著抑癌基因的角色。文獻報道，在miR-137表達減低的腫瘤細胞中恢復(fù)其表達后，細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力均受到明顯抑制[11～13]。在人眼葡萄膜黑色素瘤中，miR-137表達減低且上調(diào)其表達可以抑制葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖、多克隆形成和動物體內(nèi)的腫瘤形成能力，認為是葡萄膜黑色素瘤的抑癌基因[14]。我們前期研究顯示上調(diào)miR-137表達能抑制人眼葡萄膜黑色素瘤細胞系M23的增殖和遷移能力[7]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-137基因后葡萄膜黑色素瘤細胞M23細胞的侵襲能力受到明顯抑制，進一步證實miR-137是葡萄膜黑色素瘤的抑癌基因。

腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的前期條件是細胞獲得侵襲能力。細胞發(fā)生侵襲時失去黏附能力而變得松散利于游走，侵入細胞外基質(zhì)(ECM)并分泌MMPs降解ECM，使基底膜產(chǎn)生局部缺損，腫瘤細胞穿過這些缺損處進入血管，通過血管在遠處定植，形成轉(zhuǎn)移灶[15]。腫瘤細胞分泌的MMPs中，MMP-2和MMP-9是降解ECM的最主要成分，它們在腫瘤新生血管形成、腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成過程中均起重要作用[16,17]。MMP-2和MMP-9在葡萄膜黑色素瘤組織中的分泌水平增加[18]，它們的表達與葡萄膜黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切的相關(guān)性，兩者分泌表達增加預(yù)示著患者預(yù)后不良[19～22]。體外實驗顯示葡萄膜黑色素瘤細胞在惡性特征逆轉(zhuǎn)后，MMP-2等分泌和表達會受到抑制[23]。本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組M23細胞內(nèi)MMP-2、9蛋白表達和胞外MMP-2、9分泌水平低于對照組，提示miR-137可能通過減低MMP-2和MMP-9表達而抑制人眼葡萄膜黑色素瘤細胞的侵襲能力。

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Effect of miRNA-137 transfection on human uveal melanoma cell line invasion

CHENJun-jie1,ZHENGNa-feng,YEZi-ying,LINJun-shan,OURui-zhang,ZENGYu-ting

(1People′sHospitalofZengchengCity,Zengcheng511300,China)

Objective To investigate the effects of miR-137 gene transfection on human uveal malignant melanoma cell lines M23. Methods miR-137 mimics were transfected to M23 by Lipofectamine package LipofectamineTM2000. Cell invasion was detected by transwell invasion assay 18 h after transfection. MMP-2 and MMP-9 proteins expression were investigated by Western blot and ELISA. Results Transwell invasion assay showed that the number of M23 cells in miR-137 mimics group was significantly lower than negative control group. Western blot and ELISA confirmed that miR-137 mimics could significantly inhibit the expressions of MMP-2/-9 protein and secreting. Conclusion miR-137 gene transfection can inhibit the invaion of human uveal malignant melanoma cell by reduce the expression of MMP-2 and MMP-9.

uveal melanoma; invasion; miR-137; matrix metalloproteinase

廣東省自然科學基金資助項目(2014013301)。

陳俊杰(1979-)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向為眼部惡性腫瘤浸潤及侵襲機制。E-mail:chenjj163163@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.006

R773.3

A

1002-266X(2015)06-0018-03

2014-11-20)