血凝抑制試驗(yàn)易出現(xiàn)的問題與糾正方法

吳召坤/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫(yī)中心

本人在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作十余年，最常做的就是血凝抑制試驗(yàn)，血凝抑制試驗(yàn)常用于雞新城疫、禽流感等疫病的抗體檢測與流行病學(xué)調(diào)查，疫病診斷、防疫監(jiān)測、免疫程序的制定等工作中，該試驗(yàn)要求操作規(guī)范，精心細(xì)致，取量精確，判定及時準(zhǔn)確，在操作的過程中，稍有失誤，就會使試驗(yàn)出現(xiàn)偏差，導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。本人通過長期的實(shí)際工作，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，現(xiàn)將試驗(yàn)過程中常出現(xiàn)的問題進(jìn)行列舉，分析，提出糾正方法。

（一）在測定抗原血凝效價時，1～11孔全部百分之百凝集，判定不出抗原效價

原因：抗原效價高，超出血凝板測定范圍，解決辦法，將抗原做倍比稀釋2～3次再測即可。

（二）在測定抗原血凝效價或抗體抑制價時發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞即不被抗原凝集，又不被抗體抑制凝集，1～12孔全部為淡紅色

原因：紅細(xì)胞溶血。解決的辦法：重新配制1%的紅細(xì)胞，正常的1%紅細(xì)胞懸液靜置4～6h后，紅細(xì)胞沉于溶器底部，上清液清亮透明。

紅細(xì)胞發(fā)生溶血的原因有：

（1）紅細(xì)胞保存時間太長，超過使用期限。

（2）紅細(xì)胞懸液凍溶。

（3）PBS液配制不準(zhǔn)確。

(三)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的抗體效價誤差大于1個滴度

原因1：4個血凝單位抗原配制不準(zhǔn)確，4單位抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，混合均勻，配好的抗原室溫下放置不超過4h，不可反復(fù)凍融。為了防止4單位抗原配制不準(zhǔn)確，在作血凝抑制試驗(yàn)前必須作回歸試驗(yàn)來測定4單位抗原是否準(zhǔn)確。方法是：在血凝板的1～4排1～5孔各加0.025mlPBS 液，取配好的 4 單位抗原0.025ml加入反應(yīng)板的第一孔內(nèi)，混勻后吸取0.025ml加入第二孔，依次倍比稀釋至第4孔，從第4孔吸取0.025ml棄去，第5孔做對照，1 ～ 5 孔 各 加 0.025mlpbs液，1～5孔各加1%紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，20℃～25℃靜置40min后觀察結(jié)果，若1～2孔紅細(xì)胞完全凝集，3～4孔不凝集，則說明4單位抗原配制準(zhǔn)確，否則需重新測定抗原效價，配制4單位抗原，并作回歸試驗(yàn)。直至結(jié)果準(zhǔn)確。

原因2：陽性對照血清效價降低，陽性對照血清經(jīng)反復(fù)凍融，長期保存或保存不當(dāng)，就會使抗體效價降低，因此，陽性對照血清不可反復(fù)凍融，若要長期保存必須保存在－15℃以下，不得超過保質(zhì)期。

(四)結(jié)果出現(xiàn)慢

原因：環(huán)境溫度過低，如果環(huán)境溫度低于20℃時，結(jié)果就會出現(xiàn)慢，需延長時間才能出現(xiàn)結(jié)果，因此在作試驗(yàn)時應(yīng)將環(huán)境調(diào)到20℃～25℃。

(五)結(jié)果出現(xiàn)快，而且整板無凝集

當(dāng)試驗(yàn)環(huán)境溫度超過30℃時，反應(yīng)速度加快，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)快，往往在20min左右就可讀數(shù)，一旦時間過長，結(jié)果就會消失，使整板無凝集現(xiàn)象，會誤認(rèn)為抗體滴度為10log2。因而要求試驗(yàn)溫度應(yīng)控制在20℃～25℃之間，反應(yīng)40min及時讀數(shù)判定，不可長時間拖延讀數(shù)時間。

（六）整板無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象

當(dāng)試驗(yàn)環(huán)境溫度在20℃～25℃時，經(jīng)40min，整板無凝集，整板無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象有以下四種可能：一是8份血清抗體滴度均為10log2，二是試驗(yàn)過程中全板少了加4單位抗原步驟。三是4單位抗原已失效。四是環(huán)境溫度過高，反應(yīng)速度加快，讀數(shù)時間拖延。

如果整板無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象時，首先要查明原因，方法是用微量移液器吸取每孔內(nèi)的混懸液，當(dāng)每孔內(nèi)的混懸液容量為0.075ml時，可能是一、三、四項(xiàng)原因。當(dāng)每孔內(nèi)的混懸液容量為0.05ml時，可能是第二項(xiàng)原因。因而要對試驗(yàn)過程仔細(xì)分析，查明原因。無論那種原因引起的全板無凝集現(xiàn)象，都必須重新檢測，如果是第三項(xiàng)原因引起的，要重新配制4單位抗原，注意操作過程中專心細(xì)致，隨時檢查操作過程是否漏掉了某些步驟，規(guī)范操作，控制好試驗(yàn)過程中的環(huán)境溫度，及時判定結(jié)果。

（七）八份被檢樣品的抗體效價均為 1log2

原因1：可能8份被檢血清加后未進(jìn)行倍比稀釋，這種情況一般發(fā)生在使用八通道移液器時遺漏了將被檢血清作倍比稀釋這一環(huán)節(jié)，第一孔由于抗體滴度高發(fā)生全部抑制凝集，而2～11孔無抗體，則完全凝集（第11孔為抗原對照孔）。原因查找：用微量移液器吸取第一孔混懸液，若容量為0.1ml，而2～10孔混懸液均為0.075ml，即為這一原因造成。

原因2:當(dāng)排除原因1后，也可能8份被檢血清抗體效價均為1log2，這種情況很少發(fā)生。

在作試驗(yàn)的過程中，一定要嚴(yán)格按照操作規(guī)程，規(guī)范操作，仔細(xì)專心，避免打岔干擾，從使用器具的清洗消毒到試劑的配制，以及試驗(yàn)操作過程的每個步驟都要認(rèn)真細(xì)致，不能馬虎，做到科學(xué)、認(rèn)真、準(zhǔn)確，才能把試驗(yàn)做的更精確，無誤差，正確指導(dǎo)動物疫病防控工作。