李向陽(yáng)，周志敏，張留記

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003； 2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

·藥學(xué)研究·

人參牡丹膠囊的提取工藝研究*

李向陽(yáng)1，周志敏2，張留記3

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003； 2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

目的:優(yōu)選人參牡丹膠囊提取工藝的最佳條件。方法:采用正交試驗(yàn)法L9(34),對(duì)影響人參牡丹膠囊提取工藝的主要因素進(jìn)行了研究。結(jié)果：優(yōu)選出人參牡丹膠囊的最佳提取工藝為水煎提取最佳工藝為8倍量水，煎煮3次，每次2 h。結(jié)論:該提取工藝合理可行。

人參牡丹膠囊；人參；牡丹皮；提取工藝;正交試驗(yàn)；人參皂苷；芍藥苷

人參牡丹膠囊是按中醫(yī)益氣活血理論配伍而成的創(chuàng)新藥物，處方由人參和牡丹皮組成，具有益氣通絡(luò)、活血化瘀的功效，可用于氣虛血瘀型中風(fēng)病的治療。據(jù)報(bào)道，人參中主要含有多種皂苷、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、甾醇及其苷、多肽、黃酮等成分[1]，其中人參總皂苷是人參的主要有效成分。目前已從人參中分離提取出了人參皂苷Rb1、Re、Rg1、Rg3等40多種皂苷單體[2]，人參總皂苷及人參皂苷Rb1、Rb3和Rg1等單體具有保護(hù)腦缺血和免疫調(diào)節(jié)作用[3-5]。牡丹皮中主要含有芍藥苷、牡丹皮原苷等多種單萜及苷類成分、揮發(fā)性成分及甾醇生物堿等[6]。牡丹皮中的苷類成分具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓等多種藥理活性[7]，其中芍藥苷可改善局灶性腦缺血模型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)、腦組織含水量、組織病理學(xué)改變和血腦屏障通透性，顯著增加大腦局部血流量，抗神經(jīng)元凋亡[8-9]。考慮到人參和牡丹皮主要成分多為水溶性成分，擬采取水煎煮的提取方法。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，確定了最佳工藝參數(shù)。

1 藥品、試劑與儀器

人參和牡丹皮飲片，均購(gòu)自張仲景大藥房。芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201035)、人參皂苷Rd對(duì)照品(批號(hào)111818-201001)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)0703-200016)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào)110754-200320)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)110704-200318)，均為含量測(cè)定用對(duì)照品，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供； 甲醇、乙腈為色譜純，德國(guó)Merck.公司產(chǎn)品；水為自制重蒸水；其余試劑均為分析純。美國(guó)Waters高效液相色譜儀(2695溶劑管理系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測(cè)器，Waters柱溫箱，Empower II色譜工作站軟件)，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)日本島津公司產(chǎn)品；LIBROR L-160DTP型萬(wàn)分之一分析天平，日本島津公司產(chǎn)品；METTLER AE240型十萬(wàn)分之一分析天平，產(chǎn)地瑞士。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)因素水平的確定

擬對(duì)煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量等主要影響因素進(jìn)行考察，選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，設(shè)定的因素水平表見(jiàn)表1。

表1 煎煮試驗(yàn)的因素水平表

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按處方比例，平行稱取9份人參和牡丹皮藥材，按表3正交試驗(yàn)表的試驗(yàn)條件分別進(jìn)行煎煮，煎液濃縮，定容至100 mL量瓶中，制成1～9號(hào)樣品液。煎煮試驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)安排和實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)表3。

2.2.2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的含量測(cè)定

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)： SHIMADZU ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0—35 min，19%A；35—45 min，19%A→29%A；45—55 min，29%A；55—85 min，29%A→40%A；85—95 min，40%A→70%A；95—100 min，70%A)，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫35 ℃。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不少于3 000。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Rg12.58 mg，人參皂苷Re 1.97 mg，人參皂苷Rb12.67 mg，人參皂苷Rd 3.57 mg，至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取1～9號(hào)樣品溶液各10 mL，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，用20 mL氨試液洗滌，棄去氨水層，分取正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL量瓶中，作為1～9號(hào)供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2，10，15，20，30 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)見(jiàn)表2。

表2 回歸方程、線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)

測(cè)定法：分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，1～9號(hào)正交試驗(yàn)供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定供試品色譜中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的含量，計(jì)算出1～9號(hào)樣品液中人參皂苷的總量，見(jiàn)下表3。對(duì)人參總皂苷的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。有關(guān)人參皂苷測(cè)定對(duì)照品和供試品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

A對(duì)照品；B供試品圖1 正交試驗(yàn)人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd測(cè)定HPLC色譜圖

2.2.3 芍藥苷的含量測(cè)定

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)： SHIMADZU ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm),流動(dòng)相為0.5 mL/L磷酸水溶液—甲醇(76∶24)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫35 ℃，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不少于2 000。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷1.42 mg，至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每毫升含0.056 8 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取1～9號(hào)樣品的上清液各5mL，置三角瓶中，緩緩滴加無(wú)水乙醇15 mL，振搖，靜置約2年 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為1～9號(hào)供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液5，10，15，20，25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)見(jiàn)表2。

測(cè)定法：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，1～9號(hào)正交試驗(yàn)供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定供試品色譜中芍藥苷的含量，計(jì)算出1～9號(hào)樣品液中芍藥苷的總量，見(jiàn)下表3。對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。有關(guān)芍藥苷測(cè)定對(duì)照品和供試品的HPLC色譜圖分別見(jiàn)圖2。

A對(duì)照品；B供試品圖2 正交試驗(yàn)芍藥苷測(cè)定HPLC色譜圖

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

注：F0.10(2，2)=9.00，F(xiàn)0.05(2，2)=19.00。

由表4可以看出，因素A即提取次數(shù)對(duì)人參總皂苷和芍藥苷的提取量有極顯著影響，而因素B、C對(duì)人參皂苷影響較為顯著，對(duì)芍藥苷影響較小，不呈顯著性。由表3的直觀分析結(jié)果可知，人參皂苷的最佳提取次數(shù)為3次，芍藥苷為2次，但提取2次與3次芍藥苷提取結(jié)果接近；因素B和C的人參皂苷最佳水平分別為2 h和10倍量。因此，確定的最佳的提取工藝條件為A3B3C3，即人參牡丹膠囊水煎煮的最佳工藝參數(shù)為人參和牡丹皮加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

3 討 論

根據(jù)人參牡丹膠囊中藥材的主要有效成分水溶性較好的特點(diǎn)，選用加水煎煮的方式進(jìn)行提取。在實(shí)驗(yàn)中，分別以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和芍藥苷為測(cè)定指標(biāo)，多指標(biāo)考察,綜合分析，優(yōu)選出了人參牡丹膠囊的最佳煎煮提取工藝條件。

在人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和芍藥苷的測(cè)定中，采用與《中國(guó)藥典》2010版一部藥材項(xiàng)下含量測(cè)定方法一致的HPLC法。在測(cè)定人參皂苷時(shí)，本文所選流動(dòng)相可使Rb1和Rd的出峰時(shí)間提前，減少了分析時(shí)間，提高了工作效率;在待測(cè)成分出峰結(jié)束后，提高流動(dòng)相中乙腈的比例，去除樣品雜質(zhì)對(duì)后續(xù)測(cè)定的干擾，可有效保護(hù)色譜柱。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0067-04

R284.2

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.32

李向陽(yáng)(1968—),男(漢族),河南商丘人，副主任藥師，從事中藥質(zhì)量控制研究與藥品檢驗(yàn)工作。

河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃資助項(xiàng)目(144200510028)

2014-09-17；

2014-10-23