李德瑩++田毅紅++龔大春

摘要：以汽爆秸稈為底物，分別考察添加Fe2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+四種金屬離子對(duì)纖維素酶解性能的影響。結(jié)果表明，金屬離子的種類、用量均會(huì)影響纖維素的酶解效率。其中Fe2+、Cu2+對(duì)纖維素降解有促進(jìn)作用，當(dāng)Fe2+濃度為0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)纖維素降解促進(jìn)作用最明顯。Mg2+和Fe3+則會(huì)抑制纖維素酶解?？疾炝死w維素酶在水解過程中的吸附過程，添加Fe2+可加快纖維素酶的吸附，促進(jìn)纖維素酶與纖維素的有效結(jié)合。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；金屬離子；水解；激活；吸附

中圖分類號(hào)：Q814.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）03-0546-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.010

Effects of Metal Ion on the Hydrolysis of Steam-exploded Straw by Cellulase

LI De-yinga， TIAN Yi-hongb， GONG Da-chunc

（a. College of Materials and Chemical Engineering； b. college of Biological and Pharmaceutical Sciences；

c. Research Institute for New Energy， China Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China）

Abstract： Effects of metal ions Fe2+、Mg2+、Cu2+and Fe3+on the enzymatic hydrolysis of steam-exploded straw were studied. Results showed that the kinds and concentrations of metal ions affected yield of enzymatic hydrolysis. Fe2+ and Cu2+ improved enzymatic hydrolysis of lignocelluloses. Fe2+ significantly increased yield of enzymatic hydrolysis when the concentration was 0.6 mg/mL. Mg2+ and Fe3+ had some inhibition on the degradation of cellulose. The adsorption process of cellulase in the hydrolysis was examined. Adding Fe2+ accelerated cellulase adsorption and formed productive binding that increases accessibility of cellulose to cellulose.

Key words： cellulase； metal ion； hydrolysis； activation； adsorption

纖維素是一種可再生資源，它來源于農(nóng)業(yè)廢棄物如稻草、稻殼、麥稈等，木材廢棄物如木屑、樹皮以及城市廢棄物等。全國(guó)每年僅農(nóng)作物秸稈約有7億t，其中作為農(nóng)村燃料消耗2億t。若將其余5億t用來生產(chǎn)纖維素乙醇，可產(chǎn)乙醇7 000萬t，若再加上木材工業(yè)下腳料、制糖造紙工業(yè)下腳料和城市廢纖維垃圾等，纖維素乙醇的生產(chǎn)原料非常豐富，生產(chǎn)潛力巨大。目前，生物乙醇主要用于制備乙醇汽油。生物乙醇還將廣泛應(yīng)用于燃料電池市場(chǎng)，作為燃料電池動(dòng)力的主要來源。此外，乙醇是生產(chǎn)乙烯的理想原料，隨著石油資源的枯竭，乙醇必將代替石油成為乙烯工業(yè)的主要原料，在化學(xué)合成工業(yè)上發(fā)揮巨大的作用。因此，無論從短期的燃料市場(chǎng)來看，還是從長(zhǎng)期的化纖合成工業(yè)來分析，生物乙醇都將擁有廣闊的市場(chǎng)前景，是發(fā)展?jié)摿薮蟮木G色能源[1-3]。

木質(zhì)纖維素水解是纖維素乙醇的關(guān)鍵技術(shù)之一。利用纖維素酶進(jìn)行纖維素水解，可以避免酸水解工藝的高溫高壓苛刻條件，也可以防止對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕，但其缺點(diǎn)是反應(yīng)速度慢、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、酶成本高。因此，設(shè)法提高纖維素酶的活力可以提高轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。目前報(bào)道較多的金屬離子對(duì)纖維素酶的影響基本都采用游離酶作為考察對(duì)象，沒有涉及到反應(yīng)體系中的酶，對(duì)實(shí)際應(yīng)用意義不大[4-8]。本研究考察纖維素水解過程中金屬離子的調(diào)控效應(yīng)，以期提高纖維素酶的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

汽爆秸稈由三峽大學(xué)材料與化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 汽爆秸稈的處理 用80 ℃左右的熱水蒸煮汽爆秸稈，洗去其中含有的糠醛等雜質(zhì)，將濾渣收集并烘干，用研缽研碎并過40目篩。處理完成后，用密封袋貯藏。

1.2.2 金屬離子對(duì)汽爆秸稈水解的影響 準(zhǔn)確稱取過篩后汽爆秸稈渣10 g和0.35 g纖維素酶置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液充分?jǐn)嚢?，添加不同種類、濃度的金屬離子，于50 ℃恒溫振蕩水浴48 h，測(cè)還原糖含量，計(jì)算水解率。

1.2.3 金屬離子對(duì)酶與底物吸附的影響 每隔0、5、10、15、30、60、90 min吸取水解液2 mL于離心管中，10 000 r/min離心5 min。取上清液適當(dāng)稀釋后測(cè)蛋白質(zhì)含量。溶液中初始蛋白質(zhì)含量與濾液中蛋白質(zhì)含量之差即為吸附的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 測(cè)定方法 還原糖的測(cè)定采用DNS法[9]。纖維素酶活性測(cè)定采用濾紙酶活法[10]，即pH 4.8、50 ℃下1 g固體酶1 h內(nèi)水解濾紙生成1 mg的葡萄糖為一個(gè)濾紙酶活單位（FPA）。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[8]。所有的數(shù)據(jù)測(cè)定做2個(gè)平行樣，取平均值。纖維素結(jié)構(gòu)測(cè)定：將水解48 h后的水解液抽濾，收集濾渣，置于烘箱中干燥。干燥后用密封袋儲(chǔ)存樣品，待進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)。紅外分析采用KBr壓片法， 掃描范圍4 000 ～400 cm-1。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe3+、Mg2+對(duì)汽爆秸稈酶解的影響

由圖1、圖2可知，在Fe3+、Mg2+濃度分別為0.4 、0.8 、1.2 、1.6 mg/mL的情況下，隨著水解時(shí)間的增加，汽爆秸稈的水解率逐漸增大，在相同的水解時(shí)間里，與對(duì)照組相比，加入Fe3+、Mg2+的濃度越大，水解率越低。這說明Fe3+、Mg2+對(duì)纖維素酶解有抑制作用，且隨金屬離子濃度的增大，抑制作用越明顯。Fe3+的抑制作用可能是由于Fe3+的存在不利于底物與酶的活性中心相結(jié)合；Mg2+的抑制機(jī)理與Fe3+的抑制機(jī)理相似[11-12]。

2.2 Fe2+對(duì)汽爆秸稈酶解的影響

如圖3所示，隨水解時(shí)間增加，汽爆秸稈的水解率逐漸增大，在相同的水解時(shí)間里，與對(duì)照組相比，當(dāng)加入Fe2+濃度為0.2 mg/mL時(shí)，其水解率較低，當(dāng)加入Fe2+濃度為0.4、0.6 mg/mL時(shí)，水解率增大，且0.6 mg/mL Fe2+對(duì)汽爆秸稈的水解促進(jìn)作用最強(qiáng)，當(dāng)Fe2+濃度繼續(xù)增大到1.0 mg/mL，水解率反而降低。這種現(xiàn)象可能是由于當(dāng)Fe2+濃度較低時(shí)，F(xiàn)e2+在酶與底物之間起了連橋作用，形成了E-M-S復(fù)合物。從而更有利于底物與酶的活性中心必需基團(tuán)的結(jié)合，因而使酶活力得到提高。而當(dāng)離子濃度過高時(shí)，激活作用逐漸減弱，甚至呈現(xiàn)抑制作用。

2.3 Cu2+對(duì)汽爆秸稈酶解的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，在水解相同的時(shí)間里，當(dāng)加入Cu2+濃度為0.2、0.6、1.0 mg/mL時(shí)，水解率都有所增加，其中Cu2+濃度為0.6 mg/mL時(shí)，水解率增加最大，而當(dāng)Cu2+濃度增加為1.4 mg/mL，水解率變化不大，若Cu2+濃度繼續(xù)增大，可能會(huì)抑制纖維素水解。低濃度的Cu2+對(duì)酶解過程的促進(jìn)作用可能是由于Cu2+的存在更有利于底物與酶的活性中心相結(jié)合，從而使酶活力得到提高，水解率也相應(yīng)增大。而當(dāng)其濃度增大到一定值，由于Cu2+的重金屬作用，使蛋白質(zhì)變性，酶逐漸失活，對(duì)酶解過程產(chǎn)生抑制作用。

2.4 金屬離子對(duì)纖維素酶吸附的影響

纖維素的酶水解是固液非均相反應(yīng)，纖維素酶首先擴(kuò)散到底物纖維素的表面被吸附，然后將纖維素水解為可發(fā)酵糖[13]。纖維素酶的吸附存在平衡狀態(tài)，即吸附達(dá)到一定程度后，吸附量達(dá)到飽和。研究表明，纖維素酶在纖維上的吸附平衡時(shí)間約30～60 min[14，15]。因此，纖維素酶對(duì)纖維素的可及性是決定水解起始速率的關(guān)鍵因素。為探討金屬離子對(duì)纖維素降解的影響機(jī)制，比較加入金屬離子后對(duì)纖維素酶吸附的影響情況。水解過程中反應(yīng)體系內(nèi)蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，隨著纖維素水解反應(yīng)的進(jìn)行，水解液中蛋白質(zhì)含量先增大后逐漸減小，在30 min后水解液中蛋白質(zhì)含量幾乎不變。這表明在反應(yīng)剛開始階段，由于汽爆秸稈中原含有一定量的蛋白質(zhì)，隨著振蕩，這些蛋白質(zhì)逐漸溶解到反應(yīng)液中，使得水解液蛋白質(zhì)含量增加，而之后蛋白質(zhì)含量又迅速下降，這表明纖維素酶開始吸附到纖維素中，到30 min左右達(dá)到吸附平衡。添加Fe2+后，加快了纖維素酶的吸附速度，使纖維素酶易于吸附到纖維素中，這也與加入0.6 mg/mL Fe2+能夠提高汽爆秸稈水解率的結(jié)果相符，說明Fe2+可以促進(jìn)底物與酶的結(jié)合。

2.5 不同水解條件下纖維素結(jié)構(gòu)變化

由以上的研究了解到Fe2+對(duì)纖維素水解有一定的促進(jìn)作用。采用有機(jī)溶劑處理的方法脫除汽爆秸稈的木質(zhì)素，然后添加Fe2+，發(fā)現(xiàn)其水解率可以達(dá)到46.6%。分別將汽爆秸稈、汽爆秸稈添加Fe2+和脫木質(zhì)素的汽爆秸稈添加Fe2+水解以后得到的殘?jiān)M(jìn)行紅外光譜分析，得到的圖譜如圖6。圖譜B、C與A比較可知，3 350 cm-1、2 906 cm-1處的振動(dòng)峰增強(qiáng)，說明有更多的纖維素的β-1，4葡萄糖苷鍵斷裂，降解為還原糖，與水解率研究的結(jié)果一致，添加Fe2+對(duì)于纖維素和脫除木質(zhì)素的纖維素的水解都有促進(jìn)作用。不同處理?xiàng)l件下，纖維素樣品的紅外光譜圖相似，只是部分吸收峰的強(qiáng)度發(fā)生了變化，證明沒有新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能性基團(tuán)生成，試樣的主體化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。有文獻(xiàn)[16-18]表明，纖維素酶的吸附與木質(zhì)素有關(guān)，從紅外圖譜C上得知，木質(zhì)素特征吸收峰（1 505 cm-1）減弱較明顯，木質(zhì)素被脫除，但添加Fe2+后脫木質(zhì)素纖維素水解率較之未脫木質(zhì)素仍有較大幅度提高，其促進(jìn)作用可能源于金屬離子導(dǎo)致纖維素酶蛋白的空間構(gòu)象變化，從而影響其生物活性。

3 結(jié)論與討論

不同金屬離子在不同濃度下對(duì)汽爆秸稈酶解過程有不同程度的抑制或促進(jìn)作用。Fe2+、Cu2+在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)酶解過程有一定的促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+和Mg2+則會(huì)抑制纖維素酶解過程。其中，F(xiàn)e2+的促進(jìn)作用最明顯，在pH 4.5、汽爆秸稈10 g，酶活性12 FPU/g，F(xiàn)e2+濃度0.6 mg/mL的100 mL溶液50 ℃酶解48 h后，纖維素的水解率比不添加金屬離子的提高18.60%，采用脫除木質(zhì)素的汽爆秸稈，其水解率可以達(dá)到46.6%。底物中木質(zhì)素含量越低，金屬離子對(duì)纖維素轉(zhuǎn)化率的提高幅度也越大，通過考察添加Fe2+后纖維素對(duì)纖維素酶吸附的情況以及對(duì)水解后纖維素渣的紅外光譜分析，表明Fe2+能在一定程度上促進(jìn)纖維素酶與底物纖維素的有效結(jié)合，從而對(duì)酶解過程起到促進(jìn)作用。

此次研究了不同金屬離子在酶催化反應(yīng)體系中對(duì)纖維素酶活性的影響，其結(jié)果與游離酶的影響趨勢(shì)以及他人的研究結(jié)果不盡一致，可能的原因?yàn)樵O(shè)定的離子濃度不同或者作為不同來源的纖維素酶激活劑的特定金屬離子也不同，因而，同種離子對(duì)不同來源的纖維素酶活性的影響以及金屬離子對(duì)纖維素酶活性影響的機(jī)理等尚需進(jìn)一步研究。

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