侯金麗 馮欣

摘要：基于Sr18菌代謝產(chǎn)物在24 h內(nèi)具有顯著的殺線蟲活性，為進(jìn)一步探究其殺線蟲機(jī)理和作用規(guī)律，測定其在16 h內(nèi)對線蟲應(yīng)激能力的影響。結(jié)果表明，在4 h時(shí)處理組對外界條件刺激的敏感性明顯提高，運(yùn)動頻率均高于對照組，表明4 h為Sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲產(chǎn)生作用的轉(zhuǎn)折點(diǎn)；8 h后處理組活躍程度明顯減弱，對刺激的反應(yīng)較對照組緩慢，隨著刺激時(shí)間增加，處理組的活躍性有所增加但不顯著，表明Sr18菌代謝產(chǎn)物已產(chǎn)生明顯的藥效作用，致使線蟲對刺激反應(yīng)遲鈍。Sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲應(yīng)激能力的影響呈現(xiàn)“平穩(wěn)-上升-下降”的規(guī)律，進(jìn)一步探究Sr18菌代謝產(chǎn)物的作用機(jī)理為實(shí)踐中的合理用藥提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Sr18菌代謝產(chǎn)物；線蟲；應(yīng)激能力

中圖分類號： TS202.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0605-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.024

Effects of Sr18 Fungi Metabolites on the Stress Capability of Nematode

HOU Jin-li1，F(xiàn)ENG Xin2

（1. Henan Industry and Trade Vocational College，Department of Food Engineering，Zhengzhou 451191，China；

2.Tianjin Normal University，College of life Science/Tianjin Key Laboratory of Animals and Plants Resistance，Tianjin 300387， China）

Abstract： Based on Sr18 fungi metabolites having significant nematicidal activity in 24 h， its impact on stress capability of nematodes within 16 h was determined to further explore the possible nematicidal mechanism and actionrule. The results showed that about 4 h， the sensitivity of treatment group to external stimuli was improved significatly with exercise frequency on average higher than that of the control group， indicating that 4 h was the turning point for metabolites of fungi Sr18 to affect nematode. After 8 h，activity of the treatment group decreased significantly and its reaction to the stimulation was slower than that of the control group. With the increase of simulating time， activity of the treatment group increased with no significance， indicating that Sr18 fungi metabolites had obvious effect on nematodes and resulted in nematodes to be unresponsive to stimulation. Effects of Sr18 fungi metabolites on stress capability of nematodes had the rule of“smooth-rise-decline”. It will provide a theoretical and experimental basis for further exploring the mechanism of Sr18 fungi metabolites and rational use of drugs in the future.

Key words： Sr18 fungi metabolites； nematode； stress capability

植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原體，其寄生范圍廣，不僅對林木的危害十分嚴(yán)重，對全世界農(nóng)作物的生產(chǎn)也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界因植物寄生線蟲造成的年經(jīng)濟(jì)損失占12.3%[1]，超過1 000億美元，還給人類和動物帶來嚴(yán)重的疾病[2-4]。目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)藥劑已產(chǎn)生環(huán)境污染和增加線蟲抗藥性，使得化學(xué)殺線蟲藥劑的應(yīng)用受到一定的限制。隨著人類環(huán)保意識的提高，生物防治成為線蟲防治的主導(dǎo)[5]。絲狀真菌Sr18（Syncephalastrum racemosum）是從土壤中篩選得到的1株生防菌，其代謝產(chǎn)物在24 h內(nèi)具有極強(qiáng)的殺線蟲活性[6]。為進(jìn)一步明確Sr18對線蟲的毒殺機(jī)理，本研究選定松材線蟲為試驗(yàn)對象，研究對照組和處理組在16 h內(nèi)分別經(jīng)pH刺激、溫度刺激、機(jī)械刺激后線蟲平均運(yùn)動頻率的變化，為利用該菌開發(fā)微生物源殺線劑奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為生物防控線蟲危害提供新的途徑和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

Sr18菌株由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。在（27±1） ℃ PS液體培養(yǎng)基中120 r/min避光振蕩培養(yǎng)4 d后，過濾去掉菌體，收集培養(yǎng)液。松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）由中國林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)所提供。松材線蟲用以察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌（Batrytis cinerea，BC菌）避光（26±1） ℃飼養(yǎng)5～7 d。

1.2 方法

1.2.1 線蟲處理方法 用無菌水將線蟲稀釋為約15 000頭/mL的懸液，每0.2 mL分裝于滅菌的玻璃瓶中，同時(shí)加入代謝產(chǎn)物原液2 mL[7]，分別以處理0、2、4、8、16 h作為處理組，相應(yīng)在PS液體培養(yǎng)基中加入等量的線蟲作為對照組，置于（26±1） ℃培養(yǎng)箱中。

1.2.2 Sr18菌代謝產(chǎn)物對松材線蟲應(yīng)激能力影響的測定 ①pH 2.2刺激條件下的應(yīng)激變化。分別在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)取10條線蟲的混合液點(diǎn)于表面皿上，室溫26 ℃，在解剖鏡下觀察線蟲的形態(tài)變化和擺動頻率，同時(shí)用顯微成像儀進(jìn)行記錄；然后吸取15 μL pH 2.2的甘氨酸-鹽酸緩沖液緩慢地加到表面皿一側(cè)，觀察及記錄方法同前。平行測定3次。②pH 10.0刺激條件下的應(yīng)激變化。處理時(shí)間、觀測及記錄方法同上，所用緩沖液為pH 10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。③高溫（38 ℃）刺激條件下的應(yīng)激變化。分別在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)取10條線蟲的混合液點(diǎn)于表面皿上，室溫26 ℃，在解剖鏡下觀察線蟲的形態(tài)變化和擺動頻率，同時(shí)用顯微成像儀進(jìn)行記錄；然后將該表面皿上的線蟲進(jìn)行38 ℃高溫刺激，刺激時(shí)間為7 s，觀察及記錄方法同前。平行測定3次。④低溫（15 ℃）刺激條件下的應(yīng)激變化。處理時(shí)間、觀測及記錄方法同高溫刺激，所用低溫刺激溫度為15 ℃，刺激時(shí)間為20 s。

1.2.3 Sr18菌代謝產(chǎn)物處理后的松材線蟲對機(jī)械刺激的應(yīng)激能力 分別在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)取10條線蟲的混合液點(diǎn)于表面皿上，室溫26 ℃，在解剖鏡下用刺針分別刺激不同運(yùn)動狀態(tài)的線蟲，觀察線蟲的形態(tài)變化和擺動頻率，同時(shí)用顯微成像儀進(jìn)行記錄。平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sr18菌代謝產(chǎn)物處理后的松材線蟲對不同pH刺激的應(yīng)激能力變化

如圖1所示，在2 h內(nèi)，對照組和處理組在刺激前后運(yùn)動頻率差別不大。在4 h時(shí)，線蟲的擺動頻率發(fā)生了較大變化，處理組比對照組的平均頻率高。在pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液未刺激時(shí)，處理組為2.870次/s，對照組為1.520次/s。在pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液刺激后，平均頻率分別為3.780次/s和2.520次/s，表明處理組在4 h內(nèi)對外界刺激有了明顯的應(yīng)激反應(yīng)，即代謝物已產(chǎn)生影響。8 h后，對照組和處理組在刺激前后平均頻率差別很大，處理組在刺激前后都比對照組的平均頻率低很多。用pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液刺激處理組時(shí)，線蟲反應(yīng)極其緩慢，而對照組反應(yīng)靈敏，迅速達(dá)到較高頻率且持續(xù)時(shí)間較長。表明線蟲的反應(yīng)靈敏度及運(yùn)動能力均隨著Sr18菌代謝產(chǎn)物處理時(shí)間的增加呈下降趨勢。

如圖2所示，在相同處理時(shí)間內(nèi)，對照組和處理組在pH 10.0刺激前后的運(yùn)動頻率的變化與pH 2.2刺激相似，表明線蟲的反應(yīng)靈敏度及運(yùn)動能力均隨著Sr18菌代謝產(chǎn)物處理時(shí)間的增加呈下降趨勢。

2.2 Sr18菌代謝產(chǎn)物處理后的松材線蟲對高溫和低溫刺激的應(yīng)激能力的變化

由圖3可知，高溫38 ℃能夠促進(jìn)線蟲的活動。在相同處理時(shí)間內(nèi)，對照組和處理組在38 ℃高溫刺激前后的運(yùn)動頻率的變化與pH 2.2刺激相似，表明線蟲的反應(yīng)靈敏度與運(yùn)動能力均隨著Sr18菌代謝產(chǎn)物處理時(shí)間的增加呈下降趨勢。

由圖4可知，低溫15 ℃能夠抑制線蟲的活動。在2 h內(nèi)，對照組和處理組在刺激前后運(yùn)動頻率差別不大。在4 h、15 ℃條件下未刺激處理組線蟲的活躍性明顯高于對照組，平均頻率分別為2.700次/s和1.520次/s；經(jīng)15 ℃低溫刺激后，對照組比處理組對低溫刺激的反應(yīng)強(qiáng)烈，對照的線蟲運(yùn)動幅度變小，活動迅速減弱，平均頻率分別為0.065次/s和0.635次/s。8 h后，刺激前后處理組活躍性的變化顯著低于對照組。表明線蟲的反應(yīng)靈敏度及運(yùn)動能力均隨著Sr18菌代謝產(chǎn)物處理時(shí)間的增加呈下降趨勢。

2.3 Sr18菌代謝產(chǎn)物處理后的松材線蟲對機(jī)械刺激的應(yīng)激能力的變化

處理組“S”形運(yùn)動的線蟲經(jīng)刺激后運(yùn)動頻率加快，但無過激反應(yīng)；“C”形運(yùn)動的線蟲經(jīng)刺激后運(yùn)動頻率加快，部分呈“S”形曲線；螺旋形等不活躍的線蟲經(jīng)刺激后，2～5 s后才開始有反應(yīng)，呈伸展趨勢，幾秒后恢復(fù)原狀；過度卷曲的線蟲受刺激后無明顯變化。

3 小結(jié)與討論

線蟲經(jīng)Sr18菌代謝產(chǎn)物處理后在16 h內(nèi)的平均運(yùn)動頻率的變化趨勢為先升后降，與未刺激的對照組線蟲對比明顯不同，表明Sr18菌代謝產(chǎn)物具有快速擊倒和殺死作用，并顯示出藥效具有明顯的時(shí)間效應(yīng)。

通過對線蟲應(yīng)激能力的觀察，在4 h，處理組在刺激后的平均運(yùn)動頻率明顯高于對照組，說明處理組在短時(shí)間內(nèi)已受到Sr18菌代謝物的影響，對外界刺激的敏感性明顯增強(qiáng)，表明4 h為Sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲產(chǎn)生作用的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。8 h后處理組活躍程度明顯減弱，線蟲的運(yùn)動方式由頭尾反向轉(zhuǎn)變?yōu)轭^尾同向，最后“C”形或新月形逐漸死亡，對刺激的反應(yīng)較對照組緩慢，并且隨著刺激時(shí)間增加，處理組的活躍性雖略有增加，但不顯著。表明Sr18菌代謝產(chǎn)物有明顯的時(shí)間效應(yīng)，藥效隨時(shí)間的延長而增加。

高溫和低溫條件下由于線蟲活躍程度受到抑制，進(jìn)而影響了藥物進(jìn)入體內(nèi)和代謝活動，表現(xiàn)為對刺激反應(yīng)的幅度明顯低于對照和pH刺激，說明藥物對線蟲的作用程度受到影響，表明藥物的作用不具明顯的觸殺特征，推測該代謝物的殺線蟲機(jī)理可能為內(nèi)吸性毒殺。其具體的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究來證實(shí)。

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