楊 連, 曹永洪, 楊培龍, 黃火清*

1.中國農業(yè)科學院飼料研究所, 北京 100081;2.上猶中學, 江西 贛州, 341200

角蛋白酶的研究與應用前景

楊 連1, 曹永洪2, 楊培龍1, 黃火清1*

1.中國農業(yè)科學院飼料研究所, 北京 100081;2.上猶中學, 江西 贛州, 341200

角蛋白酶(keratinase) 是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，其來源廣泛，多種微生物在羽毛降解過程中均可產生角蛋白酶。不同菌種來源的角蛋白酶，其結構、理化性質、活性和底物也不同。其在飼料行業(yè)、制革工業(yè)和環(huán)境廢棄物處理等多個方面具有廣泛的應用前景，能夠產生巨大的社會效益和經濟效益。本文系統(tǒng)總結了角蛋白酶的來源、分類、理化性質、作用機理及其在基因工程研究等方面的一些最新進展，簡要介紹了其應用研究現(xiàn)狀，并展望了角蛋白酶的應用前景。

角蛋白；角蛋白酶；羽毛降解；應用領域

角蛋白酶是一種特殊的蛋白酶類，其能降解硬質且高度交聯(lián)的蛋白類物質如角蛋白。角蛋白有多種存在形式包括頭發(fā)、指甲、羊毛、蹄、角和羽毛等。由于角蛋白結構中含有較多的二硫鍵且高度交聯(lián)，使其結構非常穩(wěn)定，不易在環(huán)境中降解，成為了固體廢物管理的一部分。我國擁有非常豐富的角蛋白資源，年產角蛋白上百萬噸[1]。近年來，我國畜牧業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)不斷趨于規(guī)模化，羽毛作為家禽飼養(yǎng)和屠宰工業(yè)的副產物，羽毛類角質廢棄物產量越來越大，而羽毛中蛋白質和氨基酸含量豐富，是潛在的優(yōu)良蛋白質資源，其合理開發(fā)和利用不僅可以避免環(huán)境污染，還可以解決飼料蛋白來源等問題，可謂一舉多得。因此，對能將角蛋白轉化為可利用蛋白的角蛋白酶開展的研究引起了廣大學者們的關注。

角蛋白酶(keratinase)是一種特殊的蛋白酶類，能降解硬質且高度交聯(lián)的蛋白類物質如角蛋白。由角蛋白酶或角蛋白降解菌處理而得到的羽毛粉中粗蛋白含量為80%～90%，胱氨酸的含量居天然飼料之首，為2.93%，能值居中，含硫量在所有飼料中最高，含硒量較高。據(jù)測定纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量分別約為7.23%、6.78%和4.21%，高于其他動物性蛋白質飼料。賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸的含量相對匱乏。由于胱氨酸在代謝中可代替50%的蛋氨酸，所以在飼糧配方中添加適量的水解羽毛粉可補充蛋氨酸的不足。同時水解羽毛粉還具有平衡其他氨基酸的功能，應充分合理利用這一資源。此外，水解羽毛粉的過瘤胃蛋白含量大約是70%，是反芻動物良好的“過瘤胃”蛋白源，營養(yǎng)價值與棉籽餅相當，可部分替代棉籽餅添加到日糧中。因此角蛋白可加工成飼料或飼料添加劑[2]。一般每羽成年雞可得風干羽毛80～150 g，是體重的4%～5%，羽毛粉是一種潛力很大的蛋白質飼料[3]。角蛋白材料通過改性以后在醫(yī)藥方面也具有很大的應用潛力，如以人發(fā)角蛋白復合材料作為藥物載體，羊毛角蛋白改性后用作生物移植材料等[4，5]。本文概述了角蛋白酶在來源、分類、理化性質、作用機理及基因工程研究等方面的的研究進展，為角蛋白酶的應用提供參考。

1 角蛋白酶

1.1 角蛋白酶的微生物來源

1963年，Niokerson等[6]最早將具有角蛋白分解能力的酶稱為角蛋白酶。角蛋白酶來源廣泛，產生角蛋白酶的菌株大部分從家禽養(yǎng)殖加工廢棄物中分離獲得，種類繁多，包括細菌、真菌和放線菌。微生物來源角蛋白酶由于能水解硬質且高度交聯(lián)的角蛋白結構而在生物技術研究中非常重要。

可降解角蛋白的細菌主要是革蘭氏陽性菌，如芽胞桿菌(Bacillus)。 Lo等[7]從家禽養(yǎng)殖場中分離到了一種新型的羽毛降解菌，經16S rRNA序列分析其為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus),命名為Wu2。Macedo等[8]從羽毛肉湯培養(yǎng)基中分離到一種枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)，能較好地產生角蛋白酶。本實驗室分離到的芽胞桿菌(Bacillus)能在24 h內完全降解羽毛，并且其酶液也能有效降解羽毛。一些革蘭氏陰性菌也能夠產生角蛋白酶，包括溶桿菌屬(Lysobacterspp.)、弧菌(Vibrio)和寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)等。如Sangali等[9]從當?shù)丶仪蒺B(yǎng)殖場羽毛中分離到了一種弧菌kr2能夠高效降解完整羽毛。

能夠降解角蛋白的真菌有金孢子菌屬(Chrysosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)、彎孢屬(Curvularia)、枝孢屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、地絲菌屬(Geotrichum)和單格孢屬(Ulocladium)等。然而，由于這些菌屬大部分屬于皮膚癬菌，因而沒有很大的商業(yè)價值。2001年，曹軍等[10]從土壤中分離了棲土曲霉(Aspergillusterricola)，經UV突變后，固體發(fā)酵產酶活力提高了80%，達到1 980 U/g。Cavello等[11]從堿性土壤中分離到了3種具有角蛋白降解能力的真菌，其中淡紫青霉(P.lilacinum)降解能力最強。

放線菌中可降解角蛋白的菌株多為鏈霉菌屬(Streptomyces)，如費氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)、密旋鏈霉菌(Streptomycespactum)和高溫鏈霉菌(Streptomyces)等，底物范圍廣泛，能降解包括羽毛、頭發(fā)、羊毛在內很多角質底物[12]。

1.2 角蛋白酶的理化性質

角蛋白酶是在角蛋白誘導條件下由微生物產生的，菌種不同，角蛋白酶的結構、活性、底物特性以及對酶活力的影響因素等也會有差異[13]。角蛋白酶與其他蛋白水解酶的最主要區(qū)別在于其與底物的結合更緊密。

1.2.1 角蛋白酶的分類 角蛋白酶種類較多，分類方式也具有多樣性。根據(jù)其活性基團，角蛋白酶可分為為絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶；根據(jù)亞基組成，可分為單體酶和復合酶；根據(jù)溫度和酸堿性質，可分為酸性、中性和堿性角蛋白酶；根據(jù)分泌情況可將其分為胞內酶和胞外酶。

1.2.2 分子量和底物特異性 不同微生物來源的角蛋白酶分子量范圍從18 ～200 kDa不等，一般為30 kDa左右，有的致病真菌所分泌的角蛋白酶分子量高達400 kDa。本實驗室所研究的由芽胞桿菌分泌的角蛋白酶為單體酶，分子量大小為27 kDa(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

目前發(fā)現(xiàn)的多數(shù)角蛋白酶的底物范圍相當廣泛，能夠降解可溶和不可溶的蛋白底物?？扇苄缘孜锶缗Ｑ灏椎鞍?、酪蛋白、血紅蛋白，不可溶蛋白包括羽毛、羊毛、蠶絲、角質層和指甲。

1.2.3 溫度和pH范圍 角蛋白酶的最適反應溫度一般在35～75℃之間，大多數(shù)集中在45～55℃，如本實驗室正在研究的角蛋白酶最適溫度為55℃。多數(shù)角蛋白酶的最適pH范圍在中性到堿性之間[14]，本實驗室正在研究的角蛋白酶最適pH為11(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

1.2.4 影響角蛋白酶活性的因素 某些物質可增強角蛋白酶的活性，如二價鈣離子、二價鎂離子等，在通常情況下對角蛋白酶酶活均有促進作用，因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中適量添加，可能會有助于角蛋白酶的產生。磷酸鹽、巰基乙醇和維生素C等也可增強大多數(shù)菌源角蛋白酶活性，可能是由于巰基乙醇有助于打破二硫鍵從而提高角蛋白酶的酶解能力。Lo等[7]也報道在以羽毛為唯一碳源的培養(yǎng)基中額外添加碳源(葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖和乳糖)可抑制角蛋白酶的分泌或導致角蛋白酶活性降低。大部分角蛋白酶屬于絲氨酸或金屬蛋白酶，因此，PMSF、EDTA、和1，10-鄰二氮雜菲可強烈抑制酶的活性[15]。SDS對不同微生物來源的角蛋白酶的影響不同，其既可增強角蛋白酶的活性[16]，也能抑制酶的活性[17]，有些來源的角蛋白酶可在SDS存在條件下保持穩(wěn)定[15]。

1.3 微生物降解角蛋白的機理

Friedrich和Antranikian[18]曾報道pH范圍在6～9有助于角蛋白酶的產生和羽毛的降解，而且在水解產物中沒有檢測到胱氨酸和半胱氨酸，可能是由于堿性pH使胱氨酸殘基轉變成蛋氨酸殘基，而這一改變也有助于角蛋白酶的分解作用。在有角蛋白酶產生的發(fā)酵過程中，角蛋白會作為誘導物，角蛋白酶的產生通常伴隨著角蛋白的降解。然而，角蛋白酶的產生和角蛋白的降解并不是同時發(fā)生的，因此角蛋白的降解不能作為角蛋白酶分泌的標志，反之亦然。Thys等[19]曾報道Kr10菌株在的天然羽毛培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)36 h酶活力達到最高，對應于微生物生長的指數(shù)后期。而且，培養(yǎng)Kr10 0～45 h，可以檢測到培養(yǎng)基的pH逐漸升高，大部分微生物在角蛋白降解過程中都會伴隨溶液堿度和硫醇基的增加，堿度的增加是由于脫氨基作用釋放銨鹽所致[14]，硫醇基的增加是酶或者化學機制對二硫鍵的還原[16]。Ramnani等[17]報道在羽毛培養(yǎng)基發(fā)酵6 h后細菌開始繁殖，18 h時能觀察到大量的細菌。顯微觀察發(fā)現(xiàn)細菌緊密地附著在羽小枝上生長，羽軸上沒有發(fā)現(xiàn)細菌細胞。雖然微生物降解角蛋白的機理還不是很明確，但該過程可分為三個彼此相關的步驟：變性作用、水解作用和轉氨基作用。變性作用指維系角蛋白三維結構的二硫鍵被破壞，角蛋白喪失不溶性和抗酶解能力的過程。在變性作用過程中由于二硫鍵斷裂方式的不同又形成了以下四種理論，即物理壓力理論、膜電位理論、復合酶理論和無機變性理論。

2 角蛋白酶基因工程研究

Kim等[20]在2004年首次報道了角蛋白酶的晶體結構，該酶為一種枯草桿菌蛋白酶，與其他蛋白酶相比，其擁有絲氨酸或金屬蛋白酶的催化中心。另一種來源于地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)PDW-1的角蛋白酶N-端序列比對表明，其與枯草桿菌角蛋白酶有98%的相似性。事實上，PDW-1來源的角蛋白酶的氨基酸序列與枯草桿菌蛋白酶Carlsberg高度相似，僅僅表現(xiàn)在第222位氨基酸的不同，角蛋白酶中是纈氨酸，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg中是丙氨酸，而且這兩種氨基酸均屬于非極性疏水氨基酸。

2.1 角蛋白酶編碼基因

1995年，Lin等[21]獲得了地衣芽胞桿菌PDW-1的角蛋白酶編碼基因kerA；2002年，Kluskens等[22]從嗜熱厭氧菌閃光桿菌(Fervidobacteriumpennivorans)中克隆到fls，它由2 103個核苷酸組成，編碼699個氨基酸，與枯草桿菌蛋白酶有較高的相似性。梁斌等[23]根據(jù)kerA的核苷酸序列，設計引物得到了kerB角蛋白酶基因片段，基因全長1 434 bp，編碼477個氨基酸。本實驗室從能迅速降解羽毛的芽胞桿菌中克隆得到kerk全長1 368 bp，編碼區(qū)1 149 bp，編碼382個氨基酸，前30個氨基酸為信號肽，前導肽包括77個氨基酸，成熟蛋白由275個氨基酸殘基組成(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

對角蛋白酶基因研究的較為透徹的還是來源于地衣芽胞桿菌PWD-1的kerA，kerA已經在枯草芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)以及畢赤酵母(Pichiapastoris)等不同宿主中實現(xiàn)了成功表達[21]。為了提高角蛋白酶的胞外表達水平，盡可能會選擇整合質粒以及使用淀粉酶和木聚糖酶誘導型的強啟動子。在大腸桿菌中對角蛋白酶進行胞外表達時會在胞內空間積累大量的包涵體，包涵體需要再次折疊才能完成酶的活化。 Tiwary等[24]報道了來源于地衣芽胞桿菌的角蛋白酶基因kerBL，其在大腸桿菌中使用spa的啟動子和信號肽實現(xiàn)了胞外功能性表達。

2.2 角蛋白酶基因的誘導表達

角蛋白酶是一種誘導酶，當其培養(yǎng)基中存在角蛋白等底物時才能誘導角蛋白酶的表達。角蛋白酶分泌持續(xù)的時間和分泌強度也受角蛋白底物的強烈影響。Tiwary等[24]將來源于地衣芽胞桿菌的角蛋白酶基因kerBL克隆到pEZZ18載體上，并在大腸桿菌HB101中實現(xiàn)了胞外表達。Jeevana Lakshmi等[25]研究表明將野生型枯草桿菌BF11和BF12經過物理和化學誘變，其角蛋白酶活力由原來的10 KU/mL提高到了518～520 KU/mL，是原來的50倍。Hu等[26]研究表明地衣芽胞桿菌S90的角蛋白酶基因通過密碼子優(yōu)化策略實現(xiàn)了在畢赤酵母中的表達，最高的酶活力達到324 U/mL。Liu等[27]將來自于地衣芽胞桿菌BBE11-1的角蛋白酶基因在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和畢赤酵母中分別表達，重組酶的最適pH為10.0，研究發(fā)現(xiàn)Mn2+能夠抑制重組酶的活性，其他金屬離子則對其活性影響較小，此外，1 mol/L的過氧化氫處理5 h，酶活性仍保持80%。Radha等[28]報道來源于地衣芽胞桿菌MKU3的ker基因在木糖誘導型的啟動子下，在巨大芽胞桿菌中實現(xiàn)了重組表達，重組體使用牛奶平板進行篩選，其中降解圈最大的菌株在最適的發(fā)酵條件下誘導6 h，發(fā)酵液中就可檢測到角蛋白酶活力，誘導24 h后即在指數(shù)生長的后期，酶活力達到最高。本實驗室克隆到的kerk基因，已經在枯草芽胞桿菌中，在以羽毛為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基中實現(xiàn)了成功表達(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

綜上所述，芽胞桿菌、大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)在重組角蛋白酶的表達上已經取得了一定成功，但是表達水平以及重組角蛋白酶的降解活性并不是十分的理想，難以用于工業(yè)發(fā)酵生產。

3 角蛋白酶的應用研究

自然界中，每年都會產生大量角蛋白廢棄物，不僅造成了資源浪費，而且嚴重污染了環(huán)境。由微生物產生的角蛋白酶可以降解角蛋白，有著重大的經濟和社會效益[29]。因此，角蛋白酶的應用研究越來越受到研究學者們的關注，應用涉及飼料生產、醫(yī)療衛(wèi)生和制革等很多行業(yè)。

3.1 飼料生產

在我國，如今家禽養(yǎng)殖已實現(xiàn)規(guī)模化生產，蛋白類飼料短缺問題也日益嚴重，羽毛類廢棄物越來越多，其對環(huán)境的影響也不容小視。使用角蛋白酶或者角蛋白降解菌將富含角蛋白的材料轉化成氨基酸、多肽和可溶性蛋白，是一種提高角質廢棄物的營養(yǎng)物質利用率的潛在方法[30]，具有重大的經濟效益和社會效益。Grazziotin[31]曾報道非致病性的羽毛降解菌可提高蛋白飼料的產量，從而減少大豆和魚粉的使用。張榮飛等[32]在試驗日糧中添加0.12%的角蛋白酶能顯著提高斷奶仔豬的日增重和飼料轉化效率，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，推測其可能的作用途徑是角蛋白酶提高了仔豬胃腸道中營養(yǎng)物質的消化和吸收率，降解了大豆中抗原蛋白，緩解了其對腸道的過敏損傷作用，從而促進了仔豬的生長性能。

3.2 醫(yī)療衛(wèi)生

朊病毒(prion)可引起致命的神經退行性疾病，被稱為感染性的海綿狀腦病，包括瘋牛病、羊瘙癢癥和人克雅氏病。Prion蛋白具有兩種構象，PrPc和PrPsc，前者無致病性，后者可導致瘋牛病和人克雅氏病，而且PrPsc可導致正常的PrPc結構向PrPsc結構轉變，其結構與羽毛角蛋白類似，均含有β-片層結構[33]，因而嘗試使用角蛋白酶來降解Prion蛋白，有可能推動醫(yī)學的重大進步。

3.3 制革行業(yè)

制革加工技術涉及一系列的操作，其中給環(huán)境帶來污染最大的是預鞣制過程，其可產生硫化鈉、石灰、固體廢棄物，增加生化耗氧量(biochemical oxygen demand，BOD)、 化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)、溶解性總固體(total dissolved solids，TDS)[34]。由于角蛋白酶不能溶解膠原且能溫和的促進彈性組織解離而使其被廣泛的應用在脫毛過程中[24]。Macedo等[8]報道了一種新型的來源于枯草芽胞桿菌的角蛋白酶，其在脫毛過程中不僅不破壞膠原成分，而且不需要額外添加硫化物，可完全替代硫化鈉，在制革行業(yè)中具有巨大的商業(yè)價值。Macedo等[8]報道來源于枯草芽胞桿菌S14的角蛋白酶也消除了對有毒硫化鈉的需要，可減少制革過程中的環(huán)境污染。

4 展望

目前對角蛋白酶的認識還不夠深入，尤其是在角蛋白酶的酶活標定方面還不統(tǒng)一，在酶活測定時其底物主要有天青角蛋白，即利用顯色基團進行酶活的標定。此外，還有以可溶性角蛋白和羽毛粉為底物測定[35]，每種方法都存在一定的弊端。因而，由于底物和酶活標定方法的多樣性，導致對不同菌種來源的角蛋白酶產量比較起來存在一定的困難。盡管如此，由于角蛋白酶廣泛的應用，很多研究學者正從以下多個方面對其進行深入的研究。已經發(fā)現(xiàn)的很多菌株都能夠產角蛋白酶，但相對來說產酶效率不是很高，因此還需要進一步篩選高產菌株。同時，通過基因突變的方法改造角蛋白酶基因使其結構和性質更適合于工業(yè)應用，是目前的一個重要研究方向?？莶菅堪麠U菌的非致病性，無有毒副產品的產生以及安全性，使其成為商業(yè)生產胞外酶的首選。因此，構建一個角蛋白酶的枯草芽胞桿菌高效表達系統(tǒng)也是今后研究的重要方面。

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Recent Advances and Application Prospects in Keratinases

YANG Lian1, CAO Yong-hong2, YANG Pei-long1, HUANG Huo-qing1*

1.FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China；2.ShangyouMiddleSchool,JiangxiGanzhou341200,China

Keratinase is kind of specific enzyme that can degrade keratin.It derives from a wealth of sources. A variety of microorganisms can produce keratinase in the process of feather degradation. Keratinases from different strains are different in structure, physical and chemical properties, activity and also substrate. Keratinase has broad application prospects in feed industry, leather industry, and environmental waste disposal, etc., which bring enormous social and economic benefits. This paper summarizes research progress on keratinase in physicochemical properties, enzymatic mechanisms, sources and classification, as well as genetic engineering, introduces the status of keratinase application and finally proposes the application prospects.

keratin; keratinase; feather-degrading; application fields

2014-12-04; 接受日期：2014-12-11

國家科技支撐計劃項目(2013BAD10B01)資助。

楊 連，碩士研究生，主要從事芽胞桿菌表達系統(tǒng)構建研究。E-mail：yanglianryl@163.com。*通信作者：黃火清，副研究員，碩士生導師，博士,主要從事微生物高效表達系統(tǒng)研究。E-mail：huoqinghuang@126.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.01.04