陳 帥，趙延敏

( 1. 浙江育英職業(yè)技術(shù)學院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學，浙江 杭州 310035 )

科技與應用

電子自旋共振技術(shù)(ESR)對魷魚氧化三甲胺熱促分解機理研究

陳 帥1，趙延敏2

( 1. 浙江育英職業(yè)技術(shù)學院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學，浙江 杭州 310035 )

利用電子自旋共振技術(shù)(ESR)從自由基的角度探究魷魚高溫氧化三甲胺(TMAO)熱分解的刺激因子的熱促分解機理，發(fā)現(xiàn)高溫條件下氨基酸和還原糖能明顯促進魷魚中TMAO的熱分解，其中賴氨酸(Lys)和半乳糖(Gal)促進作用最強，且魷魚上清和TMAO- Fe(II)在高溫條件下形成相似的自由基六重峰信號，Lys或Gal均能使魷魚上清中自由基信號增強，判定Lys和Gal通過增強-(CH3)3N·信號促進TMAO熱分解產(chǎn)生FA。

魷魚；氧化三甲胺；甲醛；ESR

魷魚絲、烤魷魚片等魷魚制品因營養(yǎng)豐富、口味獨特、食用方便而深受廣大消費者歡迎。然而，魷魚制品中高含量內(nèi)源性甲醛(Formaldehyde，F(xiàn)A)給產(chǎn)品品質(zhì)和食用安全帶來了負面的影響[1]。因此，探究魷魚制品中內(nèi)源性FA的高溫產(chǎn)生機理 已是當務(wù)之急。研究已表明，水產(chǎn)品內(nèi)源性FA的前體物質(zhì)是氧化三甲胺(Trimethylamine-n-oxide, TMAO)。在加工過程中受到蒸煮、烘烤等高溫加熱工藝，TMAO熱分解產(chǎn)生FA、二甲胺(Dimethylamine, DMA)和三甲胺(Trimethylamine, TMA]。[1]Lin等發(fā)現(xiàn)5種魷魚在200°C 加熱 1h 90%的TMAO熱分解生成DMA和TMA。[2]Spinelli等報道魚體組織中的Fe2+, Sn2+, SO2和 半胱氨酸的代謝產(chǎn)物能顯著促進TMAO的非酶分解。[3]李豐等[4]在研究乳糖與TMAO的作用時，發(fā)現(xiàn)隨著乳糖用量增加和溫度升高，DMA、TMA和半乳糖的生成量增多。李薇霞等[5]在研究奶糖中FA的產(chǎn)生來源，發(fā)現(xiàn)FA產(chǎn)生與美拉德反應中的Strecher降解有關(guān)?？梢?，魷魚中刺激TMAO分解生成DMA和FA的關(guān)鍵內(nèi)源性促進因子，可能與氨基酸和還原糖等有關(guān)。

此外，F(xiàn)erris等在研究Fe2+對TMAO熱解的脫烷基作用時發(fā)現(xiàn)，真正起到促進其熱解作用產(chǎn)生FA的是Fe2+而不是Fe3+，而且主要是通過自由基(CH3)3N·的途徑來完成的，反應過程如下：

(CH3)3NOH+Fe2+→(CH3)3N·+Fe3++H2O

(CH3)3N·+Fe2+→(CH3)3NH+Fe3+

(CH3)3N·+Fe3+→ (CH3)2N=CH2+H++Fe2+

+

H2O

↓

(CH3)2NH2+CH2O[6]

自由基的存在能大大加大化學反應的進程，導致細胞衰老及各種疾病的發(fā)生，而電子自旋共振技術(shù)(Electron spin resonance，ESR)廣泛的應用于微量有基自由基的檢測，如檢測生物系統(tǒng)中HO·信號[7,8]，Steven等利用ESR技術(shù)檢測二甲亞砜被HO·氧化時產(chǎn)生的·CH3[9]；Ch. Kroll等利用ESR技術(shù)檢測生物醫(yī)藥品種硝酰基自由基[10]；賈佳在研究魷魚上清、鱈魚上清的自由基時，分別以PBN和DMPO作為捕獲劑，利用電子自旋共振技術(shù)(ESR)在加熱后的魷魚上清捕捉到明顯的六重峰，而且在TMAO-Fe2+體系中也檢測到相同的六重峰，從而推測得到的六重峰為-(CH3)3N·[11]；苗林林利用ESR技術(shù)，使用不同捕獲劑捕獲到類似的九重峰信號[12]，因此，推測魷魚中TMAO熱分解的一條可能途徑是通過-(CH3)3N·自由基來完成的。

本研究發(fā)現(xiàn)魷魚中TMAO熱分解產(chǎn)生FA、DMA和TMA的現(xiàn)象與氨基酸和還原糖變化有一定關(guān)聯(lián)；通過氨基酸和還原糖的體外添加試驗，篩選出促進魷魚上清、TMAO和TMAO-Fe(II)體系甲醛生成的因子賴氨酸和半乳糖，并從自由基角度闡述其促進機理。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

魷魚，浙江興業(yè)集團有限公司；TMAO、TMA、DMA純度98%，美國SIGMA公司；葡萄糖、半乳糖和乳糖，分析純，成都科龍化工試劑廠；HNO3，色譜純，上海阿拉丁試劑；三氯乙酸，純度99.5%，上海阿拉丁試劑；甲醇、乙腈，99.9%，美國TEDIA公司；甲醛標準溶液100mg/L，國家環(huán)?？偩?。

1.2 主要試驗儀器

ICS-1500離子色譜儀，美國戴安公司；HPLC1100高效液相色譜配有Agilent ODS2-C18 柱及紫外檢測器，美國Agilent公司；SIGMA3-30K冷凍高速離心機，SIGMA公司；AB-135-S電子天平，梅特勒-托利多公司；PHS-3C pH計，上海精密科學儀器有限公司；Milli-Q Century超純水系統(tǒng)，美國密理博。

1.3 魷魚上清制備

冷凍魷魚室溫解凍后，將魚肉切小塊搗碎，取一定量碎魷魚，以1：2(g:V)與Tris-乙酸緩沖液(pH 7.0)混合，勻漿，離心(3000 g，12 min)，取上清液，沉淀以1：1緩沖液混合，勻漿，重復2次，上清(即提取的魷魚上清)混合，4℃冷藏備用。

1.4 樣品處理

取魷魚肉在100℃沸水浴中處理30min，冷卻，加入1ml 7.5%TCA，離心，取上清，測定TMAO、TMA、DMA、FA和還原糖含量。配置20mM TMAO和20mM TMAO-20mM Fe(II)的體外反應體系，7種還原糖對魷魚上清、TMAO和TMAO-M Fe(II)體系FA生成的影響，具體處理方法是：分別取7中還原糖與魷魚上清、TMAO和TMAO-Fe(II)進行等體積混合，還原糖作用濃度分別為20mM和200mM，以超純水為空白對照，于100℃反應30min，同上處理后，測定FA含量。

1.5 TMAO、TMA、DMA和甲醛的檢測方法

采用離子色譜法測定樣品氧化三甲胺、三甲胺和二甲胺的含量[4]，參考李薇霞等[5]高效液相色譜法測定甲醛含量。

1.6 ESR檢測自由基

將0.5mL樣品置于2mL離心管，于100℃水浴15min，促使自由基產(chǎn)生，加入15mg PBN混勻，并于60℃保溫1h，取樣測定。ESR測定條件：室溫，中心磁場為3512.00G，微波功率為6.35mw，調(diào)制頻率為100GHz，調(diào)制幅度為2.00G，掃描40.96sec[11]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，結(jié)果以均值±標準偏差(Mean±SD)表達。采用Origin 8.0進行作圖，SPSS軟件單因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)用來比較各組間的差異，P<0.05 表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫處理對魷魚肌肉和魷魚上清TMAO熱分解的影響

注：同一行中數(shù)據(jù)右上角字母不同表示顯著差異(P<0.05)。

魷魚肌肉和魷魚上清經(jīng)100℃加熱處理30min后，F(xiàn)A、DMA、TMA和TMAO含量變化如表1所示。高溫對魷魚肌肉和上清TMAO表現(xiàn)出相似的分解規(guī)律，TMAO含量表現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，相應的FA、DMA含量顯著上升(P<0.05)，魷魚上清中TMA的變化較小，這與魷魚肌肉中可能存在其他的促進TMA形成因素有關(guān)，如酶等。研究已表明，在高溫加熱過程中阿根廷和北太魷魚胴體中TMAO分解為TMA、DMA和FA。[2,3]李薇霞等[5]在研究奶糖中FA的產(chǎn)生來源，發(fā)現(xiàn)FA產(chǎn)生與美拉德反應有關(guān)。由于高溫過程中可能存在美拉德反應，因此推測甲醛產(chǎn)生可能與外源添加氨基酸和還原糖有關(guān)。

2.2 氨基酸、還原糖對魷魚上清和TMAO-Fe(II)水溶液中FA形成的影響

注：各組因素同一列中數(shù)據(jù)右上角字母不同表示顯著差異(P<0.05)；

分別研究3種氨基酸和3種還原糖對魷魚上清及TMAO-Fe(II)模擬體系高溫FA生成的影響如表2所示。結(jié)果可見，經(jīng)過100℃處理30min后，魷魚上清和TMAO-Fe(II)模擬體系甲醛生成明顯。其中賴氨酸和半乳糖能明顯提高甲醛的含量，分別由17.8 mg/L、8.82 mg/L上升至117.30mg/L、32.47 mg/L，而葡萄糖、乳糖、甘氨酸雖能促進TMAO-Fe(II)模擬體系中FA的產(chǎn)生，但對魷魚上清的促進作用不明顯。高濃度的半胱氨酸反而能抑制FA的產(chǎn)生，這可能是因為半胱氨酸與生成的FA結(jié)合。

2.3 ESR檢測TMAO和TMAO-Fe(II)中自由基信號

分別將TMAO標準品、TMAO+2mM Fe(II) 和TMAO+20mM Fe(II) 100℃加熱處理15min，其自由基信號如圖1所示，TMAO標準品中加入Fe2+能夠明顯提高自由基信號的強度，而且自由基信號為六重峰，當Fe2+濃度由2mM增加至20mM時，自由基信號強度明顯增強，由300000增加至1750000。J P Ferris等[6]發(fā)現(xiàn)Fe2+對TMAO的脫烷基化作用是通過-(CH3)3N·自由基產(chǎn)生甲醛，因此，此自由基信號應為-(CH3)3N·自由基。

2.4 ESR檢測加熱處理后魷魚上清、魷魚上清-Lys/Gal中自由基信號

在同樣的ESR測定條件下，分別對魷魚上清、魷魚上清+賴氨酸和魷魚上清+半乳糖的自由基進行檢測，測定結(jié)果如上圖所示，加熱處理過的魷魚上清產(chǎn)生了與TMAO-Fe(II)體系相同的明顯的六重峰自由基信號，強度為200000以上 ，因此魷魚上清中FA的產(chǎn)生同樣是通過-(CH3)3N·，添加賴氨酸或半乳糖后-(CH3)3N·信號強度增強，到達400000，因此可以判定賴氨酸和半乳糖的促進機理與Fe2+對TMAO的脫烷基化作用相同，都是通過-(CH3)3N·完成。

3 結(jié)論

魷魚中氧化三甲胺高溫熱分解能產(chǎn)生甲醛、二甲胺和三甲胺，美拉德反應能促進TMAO熱分解，其中以賴氨酸和半乳糖促進作用最強，而且其熱促反應機理與Fe2+對TMAO的脫烷基化作用相同，均是以提高-(CH3)3N·自由基的強度進行的。

[1]Zhu, J. L., Li, J. R., & Jia, J. (2012). Effects of thermal process and various chemical substances on formaldehyde and dimethylamine formation in squid Dosidicus gigas[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 92, 2436-2442.

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[11]賈佳. 秘魯魷魚中氧化三甲胺熱分解生成甲醛和二甲胺機理的初步研究[D]. 杭州: 浙江工商大學, 2009:6-61.

[12]苗林林. 秘魯魷魚復合甲醛抑制劑的研發(fā)及其應用[D]. 杭州: 浙江工商大學, 2011: 1-56.

(責任編輯：孫強)

Study on the Thermal Degradation of TMAO in Squid by Electron Spin Resonance(ESR)

CHEN Shuai1,ZHAO Yan-min2

( 1.Zhejiang Yuying Collage of Vocational Technology, Hangzhou, Zhejiang 310018, China;2. Zhejiang Gongshang University, Hangzhou, Zhejiang 310035, China )

To assess the stimulatory factor of TMAO breakdown, the influence of reducing sugar to the thermal conversion of trimethymine-N-Oxide (TMAO) to formaldehyde (FA) in squid was studied. It showed that the correlation of decomposition of TMAO and reducing sugar was observed. The galactose exhibited the strongest stimulatory factor in formation of FA in the squid extract and TMAO aqueous solution. The similar promotion of the degradation of TMAO to FA, DMA and TMA was observed in two systems. The addition of Lys and Gal enhanced greatly the signal intensity in the squid extract. Therefore, Lys and Gal could promote the conversion of TMAO to FA by enhancing the signal strength of -(CH3)3N· in squid.

squid; trimethymine-N-Oxide (TMAO); galactose; formaldehyde (FA); ESR

2014-09-01

浙江育英職業(yè)技術(shù)學院校級課題(YYFW1301)

陳帥(1987- )，女，山東濰坊人，碩士，食品教研室助教。

TS207.4

A

1671-4385(2015)01-0089-04