曲亞南 徐蘇華 陳浩瀚 謝新藝 顏林 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所包裝材料容器檢驗中心 (廣州 510663)

隨著包裝技術(shù)的快速發(fā)展以及人們對包裝材料的深入研究，藥品包裝材料與藥物相容性研究越來越受到關(guān)注?！痘瘜W(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和《化學(xué)藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（網(wǎng)站征求意見稿）》有力地推動了我國藥品包裝材料與藥物相容性的研究工作。橡膠材料是最為常用的包裝材料之一，且與藥品直接接觸。由于丁基橡膠塞在加工過程中需要加入硫化劑等多種助劑，因而在膠塞中不可避免地會殘存一些未被化學(xué)鍵合或者分解硫化的物質(zhì)。這些物質(zhì)滲透在藥物中或者是吸附藥物，從而與藥物發(fā)生反應(yīng)，影響藥物的活性物質(zhì)含量，進而威脅藥物的安全性[1]。國內(nèi)學(xué)者對膠塞進行過一些研究[2～5]，研究表明當膠塞與注射劑直接接觸時，膠塞可能會吸附注射劑中的活性成份，而膠塞本身的有毒有害成份也可能遷移至注射劑中。

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）是橡膠常用的一種抗氧劑，具有抑制或延緩橡膠氧化降解而延長使用壽命的功能。研究表明 BHT 對肺、肝等組織有直接損害作用，并有可能促進腫瘤發(fā)生[6]。目前在日本、歐洲、美國已禁止在嬰兒和兒童食品中使用。在注射劑與溴化丁基橡膠塞長期直接接觸的過程中，抗氧劑BHT 也具有遷移至注射劑中的危險，對于這方面的研究還未見報道。本文首次采用固相萃取技術(shù)進行前處理、高效液相色譜法測定對乙酰氨基酚注射液和復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液中抗氧劑BHT 的含量。

1.實驗部分

1.1 試劑、材料與儀器

高效液相色譜儀（日本島津公司LC-2010A）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，BSA224S-CW）；超聲波清洗器（中國昆山超聲儀器有限公司，KQ-150DY型）；移液槍（北京青云卓立精密設(shè)備有限公司，20～200μl）；

固相萃取柱（WondaSep C18，500mg/6mL）；固相萃取儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，AES-12）；

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）對照品（Dr. Ehrenstorfer GmbH，批號：20627）；

對乙酰氨基酚注射液（鈉鈣玻璃輸液瓶及溴化丁基橡膠塞包裝，加速試驗6 個月樣品）；

復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液（鈉鈣玻璃輸液瓶及溴化丁基橡膠塞包裝，加速試驗6 個月樣品及長期試驗6 個月樣品）；

甲醇（LiChrosolv，色譜純）；二氯甲烷（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；乙醚（廣州化學(xué)試劑廠，分析純）；實驗用水為二級純化水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標準儲備溶液將抗氧劑BHT 標準品109.1mg 溶于100mL甲醇中，作為標準儲備溶液。

1.2.2 標準溶液的配制

用甲醇將抗氧劑BHT 儲備液逐級稀釋至0.2182、5455、1.091、2.182、5.455、10.91μg/mL系列標準溶液。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Inertsil?ODS-SP，5μm，4.6mm×250 mm；流動相：水：甲醇=20:80；流速：1.0mL/min；檢測波長：280nm；柱溫：40?C；進樣量：20μl。

1.4 試樣的前處理

固相萃取柱使用前分別用5mL 甲醇和5mL水活化。量取100mL 對乙酰氨基酚注射液，以約2～3mL/min 的流速通過固相萃取柱，隨后用15mL 二級純化水淋洗，負壓抽15min 后分別用2mL 甲醇，7mL 二氯甲烷依次洗脫，收集洗脫液，用甲醇稀釋至10mL，用0.45μm 濾膜過濾后待測。

2.結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

以2mL 甲醇和7mL 二氯甲烷為洗脫液，分別研究了HLB 柱（Chromclean，200mg/6mL）、PEP 柱（Cleanert，500mg/6mL）、C18 柱 對 抗氧劑BHT 的吸附情況（表1）。C18 柱對抗氧劑BHT 的吸附大于其他2 種萃取柱，其在此柱的洗脫回收率最大，達到91.95%，且C18 萃取柱的價格最便宜，故選擇C18 柱作為固相萃取柱。

表1. 固相萃取柱的選擇

表2. 洗脫液及用量的選擇

2.2 洗脫液及用量的選擇

以C18 柱為固相萃取柱，考察了5 組溶劑（8mL 甲醇，5mL 甲醇5mL 二氯甲烷混合溶液，4mL 甲醇5mL 二氯甲烷依次洗脫，2mL 甲醇7mL 二氯甲烷依次洗脫，2mL 甲醇7mL 乙醚依次洗脫）的洗脫效果。實驗表明（見表2），8mL甲醇、2mL 甲醇7mL 二氯甲烷、2mL 甲醇7mL乙醚中2mL 甲醇7mL 二氯甲烷依次洗脫的結(jié)果最好，這是由于二氯甲烷的極性最小，與吸附在C18 填料上的BHT 作用最強。5mL 甲醇5mL 二氯甲烷混合溶液、4mL 甲醇5mL 二氯甲烷、2mL甲醇7mL 二氯甲烷中2mL 甲醇7mL 二氯甲烷依次洗脫的結(jié)果最好，這是由于極性較小的二氯甲烷所占比例最大，可以洗脫出較多的抗氧劑BHT。所以選擇2mL 甲醇7mL 二氯甲烷依次洗脫作為洗脫步驟。

2.3 HPLC 條件優(yōu)化

將添加抗氧劑BHT 標準溶液的對乙酰氨基酚注射液按1.4 進行前處理后注入HPLC，比較了抗氧劑BHT 在甲醇-水比例分別為90:10、85:15、80:20 流動相色譜條件下的分離情況。結(jié)果表明，用甲醇：水=80:20 流動相進行洗脫，抗氧劑BHT 出峰較晚，保留時間約為13.4min，與對乙酰氨基酚以及未知雜質(zhì)具有較好分離度，且色譜峰尖銳、對稱。加標對乙酰氨基酚注射液的色譜圖，見圖1。

2.4 方法有效性的評價

2.4.1 檢出限

稱取抗氧劑BHT 對照品適量，用甲醇溶解稀釋，定容，將標準溶液不斷稀釋至信噪比為3計算檢出限，信噪比為10 計算定量限。抗氧劑BHT 的檢出限和定量限見表3。結(jié)果顯示抗氧劑BHT 的樣品檢出限為0.0039μg/mL，定量限為0.0121μg/mL。對乙酰氨基酚注射液的每日建議用量為200mL/day，人每日允許最大暴露量（PDE）為1.5mg/day，靈敏度滿足檢測需求。

圖1. 加標對乙酰氨基酚注射液的色譜圖

表3. 測定抗氧劑BHT 的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

表4. 測定對乙酰氨基酚注射液抗氧劑BHT 的加標回收率與相對標準偏差

表5. 測定復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液抗氧劑BHT 的加標回收率與相對標準偏差

抗氧劑BHT 作為食品添加劑每日最大服用量（ADI）為0.3mg/kg bw/day，數(shù)據(jù)獲取來源為UNEP PUBLICATIONS 發(fā)布的2,6-di-tert-butyl-pcresol（BHT）。由于未查詢到BHT 靜脈給藥的相關(guān)毒理數(shù)據(jù)，本次計算過程中使用了相關(guān)假設(shè)，所以計算出來的PDE 僅為參考值。體重取50kg，則抗氧劑BHT 的PDE=15mg/day。

由于口服、靜脈、吸入給藥會顯示出不同的毒性，也會有不同的PDE 限度。本次試驗假設(shè)靜脈給藥PDE 是口服給藥PDE 的10%。（此處的10%參考European Medicines Agency2008 年2 月21 號在倫敦發(fā)布的Guideline of the specification limits for residues of metal catalyst of metal reagents。即BHT 靜脈給藥的PDE=1.5mg/day）

2.4.2 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

以定量限1.5 倍左右作為線性最低濃度，在最佳的測定條件下，以抗氧劑BHT 色譜峰面積（A）對濃度（C，μg/mL）建立標準曲線?？寡鮿〣HT 在表3 列出的濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

2.4.3 回收率

圖2. 對乙酰氨基酚注射液樣品色譜圖

圖3. 復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液樣品色譜圖

移取100mL 對乙酰氨基酚注射液，分別加 入30μl、60μl、120μl 的BHT 標 準 儲 備 溶液，使對乙酰氨基酚注射液中抗氧劑BHT 含量為0.03273μg/mL、0.06546μg/mL、0.1225μg/mL，每個水平平行測3 個樣，其回收率和相對標準偏差見表4。結(jié)果表明，抗氧劑BHT 平均回收率在76.75%～91.95%，RSD 在1.06%～6.00%范圍內(nèi)。方法顯示了良好的準確度和精密度。

此外本試驗還用此方法對復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液進行了回收率的測定，回收率和相對標準偏差詳見表5。結(jié)果表明，抗氧劑BHT 平均回收率在106.37%～110.03%，RSD 在1.20%～6.53%范圍內(nèi)。復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液的每日建議用量為1000mL/day，人每日允許最大暴露量（PDE）為7.5mg/day，靈敏度滿足檢測需求。說明該方法也適用于復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液中的抗氧劑BHT 的檢測。

2.5 實際樣品的檢測

利用本方法對某企業(yè)生產(chǎn)的對乙酰氨基酚注射液（加速試驗6 個月樣品）及復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液（加速試驗6 個月樣品及長期試驗6 個月樣品）進行測定。樣品中均未檢出抗氧劑BHT，色譜圖見圖2、3。應(yīng)用本方法測定對乙酰氨基酚注射液中的抗氧劑BHT，可有效監(jiān)控極性注射劑中的抗氧劑BHT 含量是否超過人每日允許最大暴露量（PDE），且方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，為溴化丁基橡膠塞與極性注射液提供了技術(shù)支持。

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