王雪梅，周燕，湯鳳蓮，陳靜

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林541001）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是全身性疾病，為其他許多疾病的共同病理基礎，具有相當大的潛在危險[1]。OSAHS發(fā)病機制復雜，其動物模型的建立不易從病因、病理等方面均得到模擬。本研究利用醫(yī)用冰袋內凝膠狀物作為充填劑進行塑型而致呼吸道部分梗阻的原理，首次將醫(yī)用冰袋應用到睡眠呼吸暫停動物模型的制備中，以期建立一個穩(wěn)定、可靠、可重復的OSAHS的動物模型，并進一步研究OASHS的發(fā)病機制、病理生理改變和并發(fā)癥。

1 材料和方法

1.1 動物與材料

1.1.1 實驗動物 實驗選用雌性清潔級中國香豬12只，購自廣西大學動物實驗中心，成熟、體重基本相等，豬齡6個月，體重（24.15±2.23）kg，用隨機數(shù)字表法分為對照組（n=6）、模型組（n=6）。動物飼養(yǎng)地點為桂林醫(yī)學院動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境條件二級，溫度16～26℃，濕度40%。

1.1.2 實驗器材 醫(yī)用冰袋由北京中衫金橋生物技術有限公司生產(chǎn)；多導睡眠監(jiān)測儀由美國泰科公司生產(chǎn)；64排螺旋CT機由德國西門子公司生產(chǎn)。

1.2 動物模型制備方法

實驗前適應性飼養(yǎng)1周，實驗當天禁食、禁水，采用3%戊巴比妥鈉40mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，緩慢注射，直至動物出現(xiàn)鼾聲。動物麻醉后，實驗組：金屬注射器抽取醫(yī)用冰袋內凝膠狀物8ml、生理鹽水溶解的80萬U青霉素溶液2m l，于動物雙側咽腭部及舌根部多點進針，緩慢注射。青霉素連續(xù)注射3 d，防止局部感染。對照組在相同位置注入等量的生理鹽水。

1.3 檢測方法

1.3.1 一般情況觀察 從實驗后即刻起每天觀察動物的大體情況改變，包括呼吸時胸腹活動度、節(jié)律，口鼻、耳緣皮膚色澤，飲食飲水，毛發(fā)脫落情況及精神狀態(tài)等。

1.3.2 上氣道CT掃描 實驗動物飼養(yǎng)4周后采用苯巴比妥鈉麻醉，致實驗豬于安靜狀態(tài)，模擬睡眠，固定于仰臥位，行64排上氣道CT薄層掃描（層厚3 mm，螺距2mm，WL：40/WW：350）測量模擬睡眠狀態(tài)下軟腭區(qū)、舌骨區(qū)、會厭區(qū)咽腔經(jīng)線大小（每一數(shù)值取3人測得的平均數(shù)），各部位均行矢狀位、冠狀位、軸狀位檢查。

1.3.3 睡眠呼吸監(jiān)測 所有實驗動物均于實驗后4周，戊巴比妥鈉麻醉后致小型豬于安靜狀態(tài)，呼吸均勻，對強刺激有反應，以此狀態(tài)模擬睡眠，固定于仰臥位，依次連接胸部運動探測帶于胸部、腹部運動探測帶于腹部、鼻氣流探頭于鼻前庭、夾指型血氧飽和度探測器于右前肢足趾，并依序連接各導聯(lián)至導睡眠監(jiān)測儀。觀察平均每小時呼吸暫停次數(shù)（AI）、低通氣次數(shù)（HI）、睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）和最低血氧飽和度（SaO2）。呼吸暫停標準為：呼吸幅度<正常20%，持續(xù)10 s以上伴有30 s內出現(xiàn)1次SaO2下降4%，并隨后恢復；低通氣標準為：正常20%<呼吸幅度<正常70%，持續(xù)10 s以上伴有30 s內出現(xiàn)1次SaO2下降4%，并隨后恢復。睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)為：睡眠時平均每小時呼吸暫停與低通氣次數(shù)之和。

1.3.4 組織病理檢查 模型組實驗動物飼養(yǎng)3月后常規(guī)麻醉，四肢固定與咽腭部被皮，切開咽腭部，觀察凝膠與各組織之間的關系，并迅速取下包被凝膠的纖維膜，甲醛溶液固定，之后常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、讀片。在光學顯微鏡下觀察包被凝膠纖維膜的構成、被膜是否完整和與鄰近組織的關系以及實驗動物注射凝膠所引起的炎癥程度。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包完成統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，行方差齊性檢驗及兩樣本t檢驗。以P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察結果

對照組動物無飲食、飲水、呼吸和睡眠的變化，也未發(fā)現(xiàn)任何全身不良反應如精神萎靡、抽搐等。模型組動物從造模后第3天起出現(xiàn)明顯的白天嗜睡、睡眠打鼾、呼吸暫停等表現(xiàn)，食欲逐漸下降，精神萎靡。4周后毛發(fā)逐漸脫落且顏色變黃，對外界刺激反應遲鈍。

2.2 咽部CT掃描結果

圖1、2和圖3、4分別為對照組、模型組實驗動物上氣道CT掃描結果，圖3、4可明顯觀察到注射到咽腭部的充填劑（如標示）。與對照組比較，模型組的軟腭區(qū)、舌骨區(qū)測得氣道最小截面積、前后徑、左右徑均明顯減小（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義，會厭區(qū)上述數(shù)值無明顯變化（P>0.05），見表1。

圖1 對照組（軸狀位）

圖2 對照組（冠狀位）

圖3 模型組（軸狀位）

圖4 模型組（冠狀位）

表1 兩組中國香豬上氣道CT影像形態(tài)學參數(shù)比較 （n=6，±s）

表1 兩組中國香豬上氣道CT影像形態(tài)學參數(shù)比較 （n=6，±s）

注：?與對照組比較，P<0.01

組別軟腭區(qū)氣道形態(tài)學 舌骨區(qū)氣道形態(tài)學 會厭區(qū)氣道形態(tài)學氣道最小截面積/mm2 前后徑/mm 氣道最小截面積/mm2 前后徑/mm 氣道最小截面積/mm2 前后徑/mm 左右徑/mm對照組 65.51±1.48 10.97±0.81 8.66±0.43 106.94±8.35 8.17±1.01 13.17±2.05 96.31±1.24 22.22±1.46 10.06±0.62模型組 50.44±1.23? 8.95±0.29?6.57±0.82? 21.23±3.10? 3.71±0.49?7.00±1.35? 97.11±3.68 21.36±0.57 10.25±0.68 P值 0.000 0.001 0.001 0.000 0.000 0.000 0.62 0.21 0.62 t值 19.22 5.752 5.56 23.58 9.70 6.18 -0.51 1.335 -0.51左右徑/mm 左右徑/mm

2.3 睡眠呼吸監(jiān)測結果

模型組的AHI、AI、HI的水平顯著高于對照組（P<0.01），最低SaO2低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 兩組中國香豬睡眠生理指標的比較 （n=6，±s）

表2 兩組中國香豬睡眠生理指標的比較 （n=6，±s）

注：?與對照組比較，P<0.01

組別 AHI/（次/h） AI/（次/h） HI/（次/h） 最低SaO2/%對照組 3.13±0.20 2.35±0.10 0.67±0.82 89.60±2.75模型組 23.00±1.41? 17.50±1.87? 4.00±0.89? 75.69±0.58?P值 0.00 0.00 0.00 0.00 t值 -34.08 -19.81 -6.74 -12.14

2.4 病理學觀察結果

術后4周模型組實驗動物咽腭部仍能見到注射凝膠狀物引起的圓形隆起，手術傷口未出現(xiàn)感染。12周切開咽腭部皮膚后可見充填劑呈白色，仍保持整體結構，質地均勻，與周圍組織界限清，外表有薄而透明的包膜，與周圍正常疏松結締組織結構相仿，用鑷子牽拉，彈性好、質韌。HE染色顯微鏡下觀察，可見充填劑被染成深紫色，與周圍組織界限清楚，凝膠外表面有一層排列整齊的膠原纖維和彈性纖維形成的薄層被膜，膜內偶見散在分布的淋巴細胞及巨噬細胞，纖維成分向其內部生長，并有微小血管生成（見圖5、6）。結果顯示注射醫(yī)用冰袋凝膠狀物在咽腭部長時間保持穩(wěn)定性，且質地良好，沒有引起組織營養(yǎng)不良現(xiàn)象和組織壞死、對其周圍的組織也沒有任何損傷。

圖5 HE染色（×20）

圖6 HE染色(×40）

3 討論

OSAHS是指睡眠時上氣道塌陷阻塞引起的呼吸暫停和通氣不足，伴有打鼾、睡眠結構紊亂、頻繁發(fā)生血氧飽和度下降、白天嗜睡等病癥。OSAHS特征性的表現(xiàn)是夜間睡眠時反復發(fā)作的低氧血癥、高碳酸血癥及睡眠結構紊亂，引起組織器官缺血、缺氧，繼而引起多器官系統(tǒng)功能不全或障礙[2]。流行病學調查顯示，該病在中年人群中男性發(fā)病率為4%、女性為2%，有資料顯示廣西地區(qū)14歲以上人群打鼾發(fā)生率為27.3%，SAHS發(fā)生率4.3%[3]。OSAHS的病理生理學相當復雜，其發(fā)病機制尚未完全明確，為此，建立合適的OSAHS動物模型是研究該疾病發(fā)病機制及其治療的重要條件和基礎。在以往的OSAHS模型的研究中，慢性間歇低氧大鼠模型已被許多國內外學者用于OSAHS發(fā)病機制及其并發(fā)癥的研究[4-5]。但鼠的低氧模型繞過了造成人類阻塞性SAHS最重要的部位上氣道，且低氧處理多未考慮到動物的睡眠結構，因而不能完全模擬臨床OSAHS睡眠與覺醒狀態(tài)對血氧的影響。相比較而言，大動物模型能很好地模擬人OSAHS上氣道阻塞過程，易于進行睡眠呼吸監(jiān)測。對于狗、豬、猴等大動物常被用于實驗性上氣道阻塞，從解剖學機制上模擬OSAHS。如FARRE等[7]對動物作氣管切開置氣管套管，套管口部有一個活瓣，當動物入睡后活瓣遮擋住氣管套管口阻塞呼吸，當動物因缺氧而覺醒后活瓣打開，這一過程在電腦的控制下周期性模擬人的夜間片斷睡眠的過程。但該模型屬于有創(chuàng)模型，易發(fā)生局部感染，且人的上氣道阻塞主要位于腭平面和舌平面，而不是氣管。有學者在猴子舌根、懸雍垂、咽側壁注射液態(tài)膠造模[8-9]。猴為直立動物且舌體和懸雍垂結構與人類最接近，但猴價格昂貴，不易管理。

本研究借助醫(yī)用冰袋內凝膠狀物作為充填劑進行塑型而致中國香豬呼吸道部分梗阻的原理，首次將醫(yī)用冰袋應用到睡眠呼吸暫停動物模型的制備中。醫(yī)用冰袋廉價易得，選用中國香豬，它具有頸部短而粗，并且容易肥胖的特征，在解剖結構上與睡眠呼吸紊亂暫停綜合征患者病理解剖結構極其相似。本研究中模型組動物從造模后第3天起出現(xiàn)明顯的白天嗜睡、睡眠打鼾、呼吸暫停等表現(xiàn)，食欲逐漸下降，精神萎靡。4周后毛發(fā)逐漸脫落且顏色變黃，對外界刺激反應遲鈍。這些表現(xiàn)和OSAHS患者臨床癥狀類似。多導睡眠呼吸監(jiān)測結果顯示：模型組的AHI、AI、HI的水平分別為：（23.00±1.41）、（17.50±1.87）、（4.00±0.89）顯著高于對照組，最低SaO2為（75.69±0.58）%，低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這些睡眠生理學指標的變化均符合中華醫(yī)學會呼吸病學會提出的OSAHS的診斷標準[10]，說明應用醫(yī)用冰袋建立的OSAHS模型睡眠監(jiān)測結果類似OSAHS患者。以往X 線測量、CT、MRI和纖維喉鏡等檢查發(fā)現(xiàn),鼾癥患者存在軟腭和咽后壁增厚、上氣道狹窄等形態(tài)學改變[11]，本研究在實驗動物飼養(yǎng)4周行上氣道CT掃描，結果顯示：模型組的軟腭區(qū)、舌骨區(qū)測得氣道最小截面積分別為：（50.44±1.23）mm2、（21.23±3.10）mm2；前 后 徑 分 別 為：（8.95±0.29）mm、（3.71±0.49）mm；左右徑分別為：（6.57±0.82）mm、（7.00±1.35）mm；與對照組比較，上述均明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。本研究在模型組實驗動物飼養(yǎng)3月后行病理結果顯示：注射物周圍包膜完整，沒有引起組織損傷和壞死，證明醫(yī)用冰袋是安全的填充材料。

綜上所述，本研究采用醫(yī)用冰袋內凝膠狀物注射法建立的中國香豬阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型，與人類OSAHS臨床癥狀、病理生理改變、解剖學病因類似。注射后12周醫(yī)用冰袋內凝膠狀物的阻塞作用仍然穩(wěn)定存在，且對動物咽腔組織無嚴重損害，實驗動物可以長期存活，有利于對OSAHS的并發(fā)癥和預后進行進一步的研究?？傊?本研究建立的OSAHS動物模型的方法不僅可行、可靠，而且穩(wěn)定、可操作性強、重復性好，為下一步深入進行OSAHS疾病的相關研究奠定了基礎。

[1]ZAMARRON C,GARCLAPAZ V,RIVERIRO A,et al.Obstructive sleep apnea syndrome is a systemic disease[J].European Journal of Internal Medicine,2008,19(6):390-398.

[2]PILLA G,SHEHADEH N.Abdominal fat and sleep apnea:the chicken or the egg[J].Diabetes Care,2008,31(suppl 2):303-312.

[3]劉建紅,韋彩周,黃陸穎,等.廣西地區(qū)打鼾及睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的流行病學調查[J].中華流行病學雜志,2007,28(2):115-118.

[4]王紅陽,楊林,陳寶元.間歇性重度低氧對大鼠學習記憶影響[J].中國公共衛(wèi)生,2011,27(1):74-76.

[5]楊艷娟,程德云,鄭西衛(wèi),等.低氧性肺動脈高壓大鼠肺內表皮生長因子受體的表達[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2012,22(23):8-12.

[6]ITURRIAGA R,MOYA EA,DEL RIO R.Cardiorespiratory alterations induced by intermittent hypoxia in a rat model of sleep apnea[J].Adv Exp Med Biol,2010,669:271-274.

[7]FARRE R,ROTGER M,MONTSERRAT JM,et a1.Collapsible upper airway segment to study the obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome in rats[J].Respir PhysiolNeurobiol,2003,136(2-3):199-209.

[8]王瑋，孔德磊，康健.阻塞性睡眠呼吸暫?；颊叩挚顾厮降淖兓捌渑c呼吸調節(jié)的關系[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2011,21(28):3548-3550.

[9]PHILIP P,GROSS CE,TAILLARD J,et al.An animal model of a spontaneously reversible obstructive sleep apnea syndrome in the monkey[J].Neurobiol Dis,2005,20:428-431.

[10]中華醫(yī)學會呼吸病學分會睡眠呼吸障礙學組,阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)[J].中華結核和呼吸雜志,2012,35(1):9-12.

[11]LAN Z,LTOI A,TAKASHIMA M,et al.Difference of pharyngealmor-phology and mechanical property between OSAHS patients and normal subjects[J].Auris Nasus Larynx,2006,33(4):433-439.