陳春艷，馬暉玲，董文科

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；3.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；4.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

?

甘肅紅豆草無(wú)色花青素還原酶LAR基因的克隆和表達(dá)分析

陳春艷1,2,3,4，馬暉玲1,3,4*，董文科1,3,4

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；3.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；4.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

以甘肅紅豆草為材料，采用RT-PCR法克隆無(wú)色花青素還原酶LAR基因，分析該功能基因在甘肅紅豆草不同器官表達(dá)的差異性。結(jié)果表明，克隆的甘肅紅豆草LAR基因，與GenBank已報(bào)道LAR基因(登錄號(hào)：HM152981)序列相似性達(dá)到98.34%，其ORF長(zhǎng)為1089 bp，編碼362個(gè)氨基酸殘基；其編碼的氨基酸序列與不同屬豆科物種的相似性存在較大的差異?；蛐蛄幸炎?cè)到GenBank，序列登錄號(hào)為KP013623。LAR基因在甘肅紅豆草不同器官表達(dá)差異較大；其中葉中表達(dá)量最高，其次是花和果，莖中表達(dá)量最低，這與器官間縮合單寧含量的變化規(guī)律一致。推測(cè)其表達(dá)與甘肅紅豆草縮合單寧器官間的積累差異有關(guān)。這些研究結(jié)果也為探索縮合單寧積累和表達(dá)調(diào)控的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

甘肅紅豆草；RT-PCR；無(wú)色花青素還原酶；克隆與表達(dá)

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)為多年生草本植物，紅豆草地上部分粗蛋白質(zhì)及氨基酸含量豐富，含有一定數(shù)量的粗脂肪、多種維生素和礦物質(zhì)及其他化學(xué)物質(zhì)。紅豆草的種子產(chǎn)量和產(chǎn)草量高，結(jié)實(shí)性能較好，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全面而豐富，適口性優(yōu)良。而且它能顯著增加土壤含氮量，也是一種花蜜液數(shù)量多的植物[1]。目前，紅豆草作為優(yōu)良的牧草在甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、寧夏、青海等23個(gè)省區(qū)廣泛栽培[2]。甘肅紅豆草(Onobrychisviciifoliacv.Gansu)是由普通紅豆草和高加索紅豆草自由雜交多次混合授粉的植株中單株選擇培育成的[3]。適合我國(guó)干旱半干旱地區(qū)建立人工草地，其產(chǎn)草量接近或超過(guò)早熟、速生、抗病蟲害、高產(chǎn)、耐旱的紫花苜蓿品種。

可溶性蛋白含量高是苜蓿引起家畜臌脹病的主要原因[4]?？s合單寧能夠與可溶性蛋白質(zhì)作用生成沉淀，避免引起臌脹病，然而紫花苜蓿葉片不含縮合單寧，只在種皮中少量存在。紅豆草在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期葉片都能生產(chǎn)很高濃度的縮合單寧[5]。家畜飼用富含縮合單寧的紅豆草后不會(huì)患臌脹病，普遍認(rèn)為紅豆草是在遺傳資源創(chuàng)新途徑中和飼草利用方式解決紫花苜蓿引起牲畜臌脹病發(fā)生的一種理想牧草[6-7]。在遺傳資源創(chuàng)新方向，從紅豆草中鑒定和分離縮合單寧基因，進(jìn)而利用基因工程技術(shù)將此基因?qū)氲杰俎Ｖ腥?，不失為一條改善苜蓿品質(zhì)和適口性的有效途徑。

目前，縮合單寧合成途徑已經(jīng)基本清楚。主要由公共苯丙烷途徑、核心類黃酮-花青素途徑、縮合單寧特異途徑完成，其中縮合單寧特異途徑最終決定其積累[8]?？s合單寧特異生成途徑中有兩個(gè)關(guān)鍵酶分別是無(wú)色花青素還原酶(leucoanthocyanidin reductase, LAR)和花青素還原酶(anthocyanidin reductase, ANR)[9-10]。LAR和ANR為單寧的生成提供了兩條不同的途徑和不同的前體物質(zhì)，然而前者的底物無(wú)色花青素又是經(jīng)花青素合成酶合成的花青素成為后者的底物，LAR在縮合單寧特異合成途徑中尤為重要[11]。一些研究證實(shí)LAR基因的表達(dá)與縮合單寧的累積呈正相關(guān)[12]，但是也有LAR活性與縮合單寧累積不符的報(bào)道[13]。LAR基因表達(dá)與縮合單寧合成受到種內(nèi)和種間差異的影響[14]。為此，探清甘肅紅豆草LAR基因結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

從植物組織中提取純度高、完整性好的高質(zhì)量RNA是進(jìn)行Northern雜交、RT-PCR以及cDNA文庫(kù)構(gòu)建等分子生物學(xué)研究的必要前提[15-16]。然而紅豆草的組織和器官中富含酚、原花青素、花青素等次生代謝物以及蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子，其RNA提取難度較大，這些物質(zhì)嚴(yán)重影響RNA提取的質(zhì)量和效果。本研究通過(guò)改良總RNA提取方法，將提取獲得的總RNA粗提物純化，提出了一種有效的紅豆草總RNA的提取方法。進(jìn)而利用RT-PCR法克隆甘肅紅豆草LAR基因，分析其序列特征，與其他高等植物的LAR基因進(jìn)行相似性比較，并分析LAR基因的組織表達(dá)特征。以驗(yàn)證該方法所提取的總RNA能否滿足下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，也為紅豆草分子生物學(xué)進(jìn)一步研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料 紅豆草品種為甘肅紅豆草，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和處理方法 M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自上海生工生物工程公司，引物由北京賽百盛生物公司合成，Taq酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，SanPrep DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司，其他藥品、試劑為常規(guī)國(guó)產(chǎn)分析純。

所用的試劑為新開封試劑，用滅菌的0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)水配制，塑料耗材均需用0.1%DEPC dH2O處理24 h，高溫滅菌，烘干后備用；研缽、試劑瓶、玻璃棒、容量瓶等物品經(jīng)180℃高溫烘烤5 h，避免RNase污染。

1.2 RNA提取方法

1.2.1 CTAB法粗提RNA 取紅豆草幼嫩材料0.10 g，在液氮中研磨成粉，將粉末迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中；加入600 μL的65℃ RNA提取緩沖液 [2%β-巰基乙醇(W/V)、2%CTAB(W/V)、4%PVP(W/V)、1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)、25 mmol/L EDTA(pH 8.0)]，然后振蕩1 min，使材料裂解充分，在65℃水浴鍋中溫浴10 min，期間振蕩2～3次；然后在4℃和12000 r/min下高速離心10 min；吸取上清置于另1支1.5 mL離心管中，加入600 μL體積比為25∶24∶1的水飽和酚：氯仿：異戊醇混合液，上下顛倒混勻，放置于冰上10 min；在4℃和12000 r/min下高速離心10 min；吸取上清至另一離心管中，重復(fù)上述除蛋白步驟；吸取上清，加入167 μL 10 mol/L LiCl，上下顛倒混勻，置于-20℃冰箱3 h，在4℃和12000 r/min下高速離心20 min；棄上清液，將沉淀溶解于500 μL 0.1% DEPC水中，加入50 μL的3 mol/L NaAC(pH 5.2)，充分溶解后，再加入1375 μL -20℃的無(wú)水乙醇，混勻，放置于-70℃的超低溫冰箱中30 min，在4℃和12000 r/min下高速離心10 min，棄去上清；用70%乙醇洗滌2次，在4℃和12000 r/min下高速離心5 min；棄去上清，倒扣在濾紙上吸光殘余乙醇；沉淀于超凈工作臺(tái)中風(fēng)干，加入50 μL 0.1% DEPC水溶解RNA，此為RNA粗提物。

1.2.2 RNA的純化 取RNA粗提物100 μL，加入900 μL 0.1% DEPC水，使其溶解，然后加入1000 μL體積比為25∶24∶1的水飽和酚：氯仿：異戊醇混合液，顛倒混勻，在4℃和12000 r/min下高速離心20 min；取上清于另一支1.5 mL離心管中，立即加入200 μL的3 mol/L NaAC(pH 5.2)和500 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，放置于-70℃的超低溫冰箱中沉淀30 min，在4℃和12000 r/min下高速離心10 min，棄去上清；用70%乙醇洗滌2次，在4℃和12000 r/min下高速離心5 min；棄去上清，倒扣在濾紙上吸光殘余乙醇；沉淀于超凈工作臺(tái)中風(fēng)干，加入50 μL 0.1% DEPC水溶解RNA，將其保存于-80℃的超低溫冰箱。

1.3 RNA質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 純度和濃度測(cè)定 取純化的RNA 1 μL，以0.1% DEPC水為空白液調(diào)零，在微量分光光度計(jì)下測(cè)定OD260和OD280值。

1.3.2 凝膠電泳檢測(cè) 取純化的RNA 10 μL，以1×TBE為緩沖液，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，30 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相。

1.4 基因克隆

1.4.1 First-Strand cDNA合成 使用上海生工生物工程公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行First-Strand cDNA合成反應(yīng)，合成后產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR LAR基因 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的紅豆草無(wú)色花青素還原酶(LAR)基因(登錄號(hào)：HM152981)序列，利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN 6.0設(shè)計(jì)特異引物：

LP1：5′-CGCCCGGGATGGCGACTTCCCCAGCCAATATC-3′

SmalⅠ

LP2：5′-GCGAGCTCTCAACAGGAAGCTGTTATTGGGACTG-3′

SacⅠ

PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，引物L(fēng)P1和LP2(10 pmol/μL)各1 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性：94℃、4 min，變性：94℃、1 min，退火：57℃、1 min，延伸：72℃、1.5 min，38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4.3 與T載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及測(cè)序 按回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，按照1∶4將pMD18-T Vector與目的片段進(jìn)行連接，16℃反應(yīng)6 h。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選陽(yáng)性克隆于含100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，PCR擴(kuò)增及SmalⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆后送于上海生工生物公司測(cè)序。

1.5 LAR基因生物信息學(xué)分析

基因開放閱讀框通過(guò)NCBI提供的ORF Finder(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找；核苷酸序列相似性檢索通過(guò)NCBI的BlastN、BlastP和DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行分析；用MEGA 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和LAR類蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；用http://expasy.org/tools/protparam.html網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。通過(guò)應(yīng)用ProtScale軟件的Hphob. Kyte & Doolittle算法對(duì)LAR蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行保守功能區(qū)預(yù)測(cè)。

1.6 LAR基因組織表達(dá)特性分析

采用半定量RT-PCR方法對(duì)甘肅紅豆草LAR基因進(jìn)行組織器官特異性表達(dá)分析。分別提取甘肅紅豆草葉、莖、花、果的總RNA，以等量的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃?zhèn)溆?。運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計(jì)引物和內(nèi)參引物如下：

LARP1：5′-ACGGCACTGTCCAAGCATA-3′

LARP2：5′-TTTCCCACAAAGAAGCAAGG-3′

ActinP1：5′-GAGCGTTTCCGTTGTCCTGA-3′

ActinP2：5′-AGGTGCTGAGGGAAGCCAAA-3′

以等量的cDNA進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性：94℃、1 min，變性：94℃、30 s，退火：55℃、30 s，延伸：72℃、40 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)目的條帶的亮度來(lái)分析基因表達(dá)的差異。

1.7 縮合單寧含量的測(cè)定

分別取甘肅紅豆草葉、莖、花、果各0.5 g，液氮研磨成粉末狀，加入3 mL提取液[含0.5%乙酸的70%丙酮(V/V)]研磨至勻漿，于5000 r/min下離心10 min，取上清液，沉淀用3 mL提取液清洗2次，合并上清液，并定容至10 mL；吸取2 mL上清液加入2 mL水和2 mL三氯甲烷且充分搖勻后于5000 r/min下離心10 min去除葉綠素(重復(fù)3次)；上清液即為提取液。采用正丁醇-鹽酸法[17]測(cè)定縮合單寧含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

RNA的純度和完整性是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成功與否的重要因素。利用改良CTAB法分離得到的甘肅紅豆草總RNA，經(jīng)微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值處于1.8～2.0之間(表1)；不同器官RNA電泳顯示28s和18s條帶較清晰，且28s條帶的亮度高于18s條帶(圖1)，結(jié)果表明得到的總RNA既未發(fā)生降解，又無(wú)DNA、蛋白質(zhì)等污染，質(zhì)量和純度較高。

表1 甘肅紅豆草不同器官總RNA的濃度及純度

2.2 LAR基因的擴(kuò)增及克隆

圖1 甘肅紅豆草不同器官的總RNAFig.1 Total RNA of different organs in O. viciifolia cv.Gansu 1：莖 Stem，2：葉 Leaf，3：花 Flower，4：果 Fruit.

為確定改良CTAB法提取的紅豆草總RNA能否滿足下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。以該法提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到約1100 bp左右的片段(圖2)?；厥誔CR產(chǎn)物，連接到pMD18-T Vector上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及SmalⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，得到的目的片段大小約為1100 bp(圖3，圖4)。表明這些克隆為陽(yáng)性克隆，將其命名為：pMD-LAR，送交測(cè)序公司測(cè)序。

2.3 測(cè)序結(jié)果及序列分析

本研究克隆的甘肅紅豆草LAR基因已登記在GenBank(登錄號(hào)：KP013623)，將核酸序列用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析，它與紅豆草LAR基因(登錄號(hào)：HM152981)具有98.34%的相似性。其開放閱讀框架為1089 bp，包括362個(gè)氨基酸編碼區(qū)和一個(gè)終止密碼子(TAG)。與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄相似性較高的幾種植物L(fēng)AR基因核酸BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該序列與豆科其他屬植物百脈根、蒺藜苜蓿、大豆、豌豆和大百脈根相似性在76%～93%，與杜鵑花科兔眼藍(lán)莓、?？破【苹ê退N薇科甜櫻桃的相似性低于75%(表2)。說(shuō)明同屬間LAR基因具有很強(qiáng)的保守性，但不同物種間LAR基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生較大變異。

圖2 LAR基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of LAR gene M：DL2000 Marker；1: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR product.

圖3 陽(yáng)性克隆的PCRFig.3 PCR analysis of positive clonesM：DL1000 Marker；1,2：陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物 Positive clones PCR products.

圖4 陽(yáng)性克隆的雙酶切鑒定Fig.4 Double digestion of positive clonesM：DL1000 Marker；1,2：陽(yáng)性克隆SmalⅠ和SacⅠ雙酶切Positive clones digestion by SmalⅠ and SacⅠ.

2.4 蛋白特性分析

Protparam軟件分析甘肅紅豆草LAR蛋白分子式為C1774H2802N470O526S17，分子量為39675.6，編碼362個(gè)氨基酸，其中異亮氨酸含量最高(9.1%)，色氨酸最少(0.6%)。理論等電點(diǎn)為5.95，原子數(shù)為5589，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為36，帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為42。脂肪系數(shù)為92.35。不穩(wěn)定系數(shù)為37.84，屬于穩(wěn)定蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，基因編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，為非分泌性蛋白(non-secretory protein)。第20位的甘氨酸(Gly)具有最高的分值2.2，疏水性最強(qiáng)；第331位的賴氨酸(Lys)具有最低的分值-2.822，親水性最強(qiáng)；平均親水性(grand average of hydroelectricity，GRAVY)值為-0.064；親水性氨基酸平均分布在整個(gè)肽鏈中，且多于疏水性氨基酸(圖5)，為親水蛋白。利用CDD保守功能區(qū)在線分析LAR的保守區(qū)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)LAR編碼的氨基酸序列具有典型的苯(基)吡喃酮芐基醚還原酶(PCBER，phenylcoumaran benzylic ether reductase)的特征結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈脫氫/還原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)超家族成員(cd05259)；此氨基酸序列含有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)[NAD(P) binding site]和賴氨酸活性位點(diǎn)(active site lysine)(圖6)。

甘肅紅豆草LAR與其他物種LAR氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，其LAR氨基酸序列與豆科植物紅豆草、蒺藜苜蓿、百脈根的相似性最高，分別達(dá)到96.44%，79.01%和73.28%；與薔薇科甜櫻桃、杜鵑花科兔眼藍(lán)莓和?？破【苹ǖ南嗨菩宰畹停謩e為62.53%，60.76%和60.66%。甘肅紅豆草LAR氨基酸序列與同科植物間的相似性為67.68%～96.44%，LAR編碼的氨基酸序列在豆科植物不同種間差異明顯，這與核酸序列變化的特征基本一致(圖7)。甘肅紅豆草LAR與其他科植物比較，其相似性更低。說(shuō)明在同源關(guān)系相近的植物中LAR基因的保守性很強(qiáng)。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)NCBI下載的9個(gè)物種的LAR氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)甘肅紅豆草LAR蛋白與豆科植物紅豆草親緣關(guān)系最近；它與豆科植物蒺藜苜蓿和豌豆的親緣關(guān)系也較近，其次為豆科植物大豆、百脈根和大百脈根。LAR蛋白與杜鵑花科兔眼藍(lán)莓、?？破【苹ê退N薇科甜櫻桃的親緣關(guān)系相對(duì)最遠(yuǎn)(圖8)。豆科不同物種明顯聚類成一組，而其他科植物聚類為另一組。說(shuō)明不同物種的LAR蛋白具有明顯的種屬特性，LAR蛋白在種間的變化也反映了植物學(xué)分類特征。

表2 甘肅紅豆草LAR基因與其他植物L(fēng)AR基因cDNA序列相似性比較

圖5 LAR氨基酸序列疏水性分析Fig.5 The analysis of hydrophobicity of LAR polypeptide

圖6 預(yù)測(cè)的LAR蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Putative conversed domains of LAR protein

圖7 不同種LAR氨基酸序列比較Fig.7 Comparison of the amino acid sequences of LAR in different species O. viciifolia cv.GS：甘肅紅豆草(未公布)；O. viciifolia：紅豆草(AEF14422)；M. truncatula：蒺藜苜蓿(XP-003591830)；L. corniculatus：百脈根(ABC71331)；P. sativum：豌豆(AII26024)；G．max：大豆(AME23933)；L. uliginosus：大百脈根(AAU45392)；P. avium：甜櫻桃(ADY15310)；V. ashei：兔眼藍(lán)莓(AB610768)；H. lupulus：啤酒花(AEV899641)；Consensus：表示一致性序列，并在序列下用小寫字母列出；根據(jù)保守程度高低依次使用黑色、紅色和藍(lán)色陰影表示。括號(hào)中的編號(hào)為GenBank登錄號(hào)。Consensus indicates same sequences and are listed below in lowercase letters. According to the degree of conservation, black, blue and red are indicated. The numbers in parentheses indicate accession number of GenBank.

2.6 不同器官LAR基因表達(dá)和縮合單寧含量

采用半定量RT-PCR的方法分析LAR基因在莖、葉、花、果中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖9。半定量結(jié)果表明LAR在甘肅紅豆草的各個(gè)器官中均表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，其次是花和果，在莖中表達(dá)量最低。縮合單寧含量在器官間的高低變化特征與LAR基因表達(dá)特征一致(圖10)。

圖8 LAR蛋白與其他物種LAR類蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of LAR proteins in O. viciifolia cv.Gansu and other species GenBank登錄號(hào)與圖7同。Accession number of GenBank is the same as Fig.7.

3 討論

圖9 甘肅紅豆草不同器官LAR表達(dá)的半定量RT-PCRFig.9 Semi-quantitative RT-PCR of LAR expression in different organs of O. viciifolia cv.Gansu

圖10 甘肅紅豆草不同器官縮合單寧含量Fig.10 Condensed tannins contents in different organs of O. viciifolia cv.Gansu

3.1 甘肅紅豆草總RNA提取法的改良及其效果評(píng)價(jià)

目前，對(duì)不同物種植物和組織器官提取RNA的方法進(jìn)行了廣泛的研究，已獲得一些科學(xué)高效的方法[18-20]。但是仍然不能滿足實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程的需要，表現(xiàn)出不同種類的植物提取方法和效果差異較大，同一種植物不同的組織其RNA提取方法也需要調(diào)整；即使同一種植物同一組織，因植株基因型不同，RNA提取方法也可能不相同[18-21]。因此，根據(jù)植物組織的特點(diǎn)，摸索出適合不同植物針對(duì)性強(qiáng)的高質(zhì)量RNA提取方法十分必要。

紅豆草在生長(zhǎng)過(guò)程中積累了諸如縮合單寧、多糖等大量的次生代謝物。與同科植物紫花苜蓿比較，紅豆草葉片積累更多的縮合單寧[5]。其組織中RNase的活性也較高，這些因素導(dǎo)致紅豆草RNA的提取難度更大。因此，獲得高質(zhì)量的RNA成為進(jìn)行紅豆草分子生物學(xué)研究首要需解決的問(wèn)題。本研究起初嘗試多種商業(yè)試劑盒提取紅豆草RNA，但在提取效果和穩(wěn)定性方面都難以滿足基因克隆和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。為此，對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行改良。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在最初的提取緩沖液中加入4%PVP以防止次生代謝物與RNA結(jié)合；加入2%β-巰基乙醇以減少多酚物質(zhì)的干擾；利用水飽和酚∶氯仿∶異戊醇抽提以去除DNA、蛋白質(zhì)及葉綠素、花青素等色素類物質(zhì)對(duì)RNA的干擾。通過(guò)使用LiCl選擇性沉淀RNA，使RNA與多糖有效分離。將2管粗提RNA合并為1管進(jìn)行純化，這樣既消除了多酚、次生代謝物及色素的影響，還能彌補(bǔ)純化過(guò)程中RNA的損失，保證了RNA的含量，提高其純度。應(yīng)用該方法提取的紅豆草RNA，28s和18s條帶較清晰，無(wú)DNA污染，同時(shí)在下游反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中得到成功的應(yīng)用。改良的RNA提取方法簡(jiǎn)單、有效，所使用藥品為普通生化試劑。在提取的RNA效果、質(zhì)量和價(jià)格方面與一般的商業(yè)試劑盒相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，是一種實(shí)用的方法。另外，提取純化后獲得的RNA具有穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，可適用于紅豆草不同器官RNA的提取和下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3.2 甘肅紅豆草LAR基因序列和表達(dá)分析

植物次生代謝物合成與積累量取決于其合成途徑中的限速酶，限速酶在植物次生代謝物生物合成途徑中往往位于代謝支路分叉口或途徑的下游。植物縮合單寧合成代謝途徑末端酶的無(wú)色花青素還原酶(LAR)基因克隆與分析，有助于解析植物次生代謝縮合單寧合成和積累的機(jī)制。本研究對(duì)RT-PCR克隆的甘肅紅豆草LAR基因cDNA片段利用相關(guān)軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其LAR基因具備一個(gè)完整的開放閱讀框架，大小為1089 bp；它屬于SDR超家族成員，含有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和賴氨酸活性位點(diǎn)(圖6)。這與依賴于無(wú)色花青素還原酶催化生成縮合單寧需要NAD(P)H參與的研究結(jié)果一致[22]。研究也發(fā)現(xiàn)豆科山螞蝗屬植物銀葉藤[22]和蓼科植物金蕎麥[23]LAR蛋白同樣含有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和賴氨酸活性位。由此推斷該蛋白具有花青素還原酶的典型的結(jié)構(gòu)特征和生物特性，超量表達(dá)可以提高縮合單寧的含量。

甘肅紅豆草LAR基因全長(zhǎng)序列與同屬植物已知序列[24]的相似性高達(dá)98%，與不同屬的幾種豆科植物的相似性在76%～93%，而與其他科植物的相似性在75%以下(表2，圖7，8)，聚類分析表明豆科與非豆科幾種植物明顯聚為兩類。說(shuō)明在同源關(guān)系相近的植物中LAR基因的保守性強(qiáng)，這與其他學(xué)者對(duì)其他基因在不同物種同源性分析時(shí)的結(jié)論一致，即屬內(nèi)同源性高，屬間或種間相對(duì)低[25-27]?？梢姡琇AR序列在不同種植物間的差異基本符合植物學(xué)分類，在一定程度上反映不同物種的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。甘肅紅豆草LAR與其他幾種不同屬豆科植物和其他科植物在核酸序列的相似性都存在較大的差異(表2)?？梢姡琇AR蛋白在進(jìn)化上多樣性，即它們是由不同祖先蛋白趨同進(jìn)化的結(jié)果[26]。

縮合單寧含量高低影響牧草飼用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)縮合單寧對(duì)于植物具有抗紫外線、抗病、抗蟲、清除自由基等功能。適量地增加牧草中縮合單寧的含量可以減緩反芻動(dòng)物瘤胃中大量蛋白的快速分解，進(jìn)而避免形成過(guò)多氣體而造成胃和腸道腫大導(dǎo)致的臌脹病。大量研究表明LAR基因的表達(dá)與縮合單寧的累積有關(guān)[10,12,28]。本研究證實(shí)，LAR基因在甘肅紅豆草的不同器官中均有表達(dá)且具有很強(qiáng)的組織特異性，其中在葉中表達(dá)量最高，其次是花和果，在莖中只有微量表達(dá)。研究也發(fā)現(xiàn)縮合單寧含量在不同器官的變化順序依次為葉>花>果>莖?？赏茢喔拭C紅豆草LAR表達(dá)和縮合單寧的合成密切相關(guān)。毛白楊LAR表達(dá)在不同器官差異顯示，PtrLAR1和PtrLAR3在根中含量最高，其次是莖、成熟葉片，在幼葉和葉柄中含量較低，這也與毛白楊器官間縮合單寧含量的差異順序一致[7]。研究也證實(shí)葡萄編碼無(wú)色花色素還原酶的VvLAR基因通過(guò)其組織及時(shí)空表達(dá)的特異性調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中原花色素的種類和積累[10]。進(jìn)一步說(shuō)明編碼無(wú)色花色素還原酶的LAR基因在器官間的表達(dá)量差異較大，具有很強(qiáng)的組織和時(shí)空表達(dá)的特異性，而且與縮合單寧積累密切相關(guān)，也可能影響牧草的產(chǎn)量和品質(zhì)[29]。可見，LAR基因在不同器官間表達(dá)差異的分子機(jī)制的研究也十分必要，這將為調(diào)控縮合單寧的積累提供必要的借鑒。

4 結(jié)論

以甘肅紅豆草為材料，采用常規(guī)CTAB法提取總RNA后，增加總RNA粗提物的純化步驟，得到高質(zhì)量的總RNA。以獲得的總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR克隆無(wú)色花青素還原酶LAR基因。獲得的LAR基因與已發(fā)表的LAR基因具有98.34%的相似性，其開放閱讀框長(zhǎng)為1089 bp，編碼362個(gè)氨基酸殘基；預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)具有典型的苯(基)吡喃酮芐基醚還原酶的特征結(jié)構(gòu)域，含有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和賴氨酸活性位點(diǎn)。注冊(cè)該基因到GenBank中，注冊(cè)號(hào)為KP013623。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，LAR基因在甘肅紅豆草葉中表達(dá)量最高，其次是花和果，莖中表達(dá)量最低，這與器官間縮合單寧含量的變化規(guī)律一致，推測(cè)LAR表達(dá)與縮合單寧器官間的積累差異有關(guān)。這些成果的取得為紅豆草種質(zhì)資源改良提供理論支持和技術(shù)保障，也為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高紫花苜蓿葉片縮合單寧的含量，以改善紫花苜蓿品質(zhì)、培育抗臌脹病苜蓿新品質(zhì)提供理論依據(jù)。

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Cloning and Expression Analysis of a Leucoanthocyanidin Reductase (LAR) Gene fromOnobrychisviciifoliacv.Gansu

CHEN Chun-Yan1,2,3,4, MA Hui-Ling1,3,4*, DONG Wen-Ke1,3,4

1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofAgronomy,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China; 3.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Lanzhou730070,China; 4.Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

A leucoanthocyanidin reductase (LAR) gene was cloned using RT-PCR fromOnobrychisviciifolia(sainfoin) cv. Gansu, and the level of LAR gene expression was analyzed in different plant organs. The LAR gene sequence fromO.viciifoliacv. Gansu shared a high level of similarity (98.34% homology) with anO.viciifoliaLAR gene in GenBank (accession No: HM152980). However, the coding sequence of amino acids is obviously different from those in other genera of the Fabaceae. The open reading frame (ORF) comprised 1089 bp, encoding 362 amino acid residues. The sequence of the LAR gene from the present study was submitted to GenBank with the accession number KP013623. LAR expression differed between plant organs ofO.viciifoliacv. Gansu. LAR expression was highest in leaves, followed by flowers and fruit, and was lowest in stem tissues, which corresponded to concentration of condensed tannins in different organs ofO.viciifoliacv. Gansu. It is inferred that LAR gene expression is in some way involved in condensed tannin accumulation inO.viciifoliacv.Gansu. These results provide fundamental information and a method for exploring the regulation mechanism of condensed tannin accumulation.

Onobrychisviciifoliacv.Gansu; RT-PCR; leucoanthocyanidin reductase; cloning and expression

10.11686/cyxb2014452

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-11-03；改回日期：2015-01-07

甘肅省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1104NKCA087)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200299)資助。

陳春艷(1977-)，女，甘肅蘭州人，實(shí)驗(yàn)師，在讀博士。E-mail:ccy0713@126.com *通訊作者Corresponding author. E-mail:mahl@gsau.edu.cn

陳春艷，馬暉玲，董文科. 甘肅紅豆草無(wú)色花青素還原酶LAR基因的克隆和表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(6): 177-187.

Chen C Y, Ma H L, Dong W K. Cloning and Expression Analysis of a Leucoanthocyanidin Reductase (LAR) Gene fromOnobrychisviciifoliacv.Gansu. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 177-187.