陳永濤，金吉林，張興無，李興忠，羅 會(huì)

（貴州省果樹科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550006）

煙草在整個(gè)生育過程中遭受多種病害及蟲害的危害，使其產(chǎn)量與品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前防治煙草病蟲害的方法主要是種植抗病蟲品種和藥劑防治蚜蟲。由于農(nóng)藥在煙草上會(huì)有殘留以及會(huì)對環(huán)境產(chǎn)生污染，所以選育和種植抗性品種在綜合防治煙草病蟲害方面就成為最經(jīng)濟(jì)有效的方法［2］。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，將來源于動(dòng)植物和微生物等的抗病蟲基因?qū)胫参镆垣@得抗病蟲植株，進(jìn)行作物抗病蟲品種的培育逐漸成為植物病蟲害防治的發(fā)展趨勢之一［3-4］。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將介導(dǎo)病毒抗性的基因?qū)霟煵?，獲得抗病毒病及抗蟲的轉(zhuǎn)基因煙草，能夠有效抵御煙草病蟲害危害。我們對近30 a來基因工程技術(shù)在煙草中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 抗病毒病轉(zhuǎn)基因煙草

近年來，利用基因工程防治煙草病毒病的主要策略，包括導(dǎo)入衣殼蛋白基因、利用病毒的復(fù)制酶基因、利用反義RNA、衛(wèi)星RNA、植物編碼的抗病毒基因及移動(dòng)蛋白等［5］。

1990年，Golemboski等將TMV U1株系的一段核酸序列轉(zhuǎn)入煙草，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株在用TMV U1株系病毒粒子或病毒RNA接種時(shí)都表現(xiàn)出高度抗性［6］。1994年，Carr和Gal-on認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的復(fù)制酶蛋白在病毒的侵染過程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮其正常功能，從而打破了病毒正鏈和負(fù)鏈復(fù)制的平衡，或是干擾了控制復(fù)制酶活性的反饋抑制途徑［7］。1994年，劉玉樂等將普通煙草G140和表達(dá)黃瓜花葉病毒（CMV）的衛(wèi)星RNA的轉(zhuǎn)基因煙草Sat-G140進(jìn)行抗煙草花葉病毒（TMV）的侵染試驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草Sat-G140表現(xiàn)的感染TMV的癥狀較輕，說明衛(wèi)星RNA可減弱 TMV引起的癥狀［8］。1995年，Lomonossoft等認(rèn)為，在RNA水平上，是轉(zhuǎn)錄出的mRNA與病毒的復(fù)制酶進(jìn)行了無效結(jié)合從而抑制病毒復(fù)制酶的正常功能，或是mRNA誘導(dǎo)了植物的自然抗病性等［9］。1999年，張振臣等發(fā)現(xiàn)，將黃瓜花葉病毒FNY-CMV株系的RNA3 CDNA克隆，構(gòu)建運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）基因，再用土壤農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌（LBA 4404）介導(dǎo)將該基因轉(zhuǎn)入煙草NC89，經(jīng)抗性鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對CMV有一定的抗性［10］。2001年，黃曉躁等將番茄花葉病毒移動(dòng)蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草中，并用卡那霉素篩選獲得了一系列的抗性苗，活性測試證明25%的抗性苗有較好的抗番茄花葉病毒的特性［11］。2002年，唐嘉義等報(bào)道，將番茄斑萎病毒（TSWV）的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草后，就獲得了抗TSWV的轉(zhuǎn)基因煙草，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因煙草對TMV也有一定的抗性［12］。2003年，郭興啟等報(bào)道，通過LBA 4404介導(dǎo)的方法將非翻譯的馬鈴薯YN病毒（PVYN）PVYNCP基因轉(zhuǎn)入煙草NC89后，獲得了高度抗PVYN的轉(zhuǎn)基因植株。并初步證明，對PVYN的侵染也具有高度抗病性［13］。2005年，張凱等將TMV的部分運(yùn)動(dòng)蛋白基因（駐MP）構(gòu)建成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，插入植物表達(dá)載體pBin438上，通過三親交配法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EH105后，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草品種云煙87，獲得了50株轉(zhuǎn)基因煙草。用TMV對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行挑戰(zhàn)接種，癥狀觀察和病毒濃度的TAS-ELISA檢測表明，轉(zhuǎn)基因煙草對TMV的抗性包括3種類型：免疫型占10%，抗病型占4%，感病型占86%［14］。2007年，孟凡宏等將水稻黃單胞細(xì)菌白葉枯致病變種（Xanthomonas oryzae v.oryzae）編碼的HarpinX100的hrfA基因及其N-末端缺失突變基因AB分別連接到雙元載體pBI121上，構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因載體i，并經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化土壤桿菌EHA105，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用卡那霉素抗性篩選再生植株。通過PCR擴(kuò)增檢測了轉(zhuǎn)化煙草中的靶基因序列即35S啟動(dòng)子序列，對T1代PCR陽性植株進(jìn)行了PCR-Southern雜交和RT-PCR分析。結(jié)果顯示，外源基因已整合到轉(zhuǎn)基因煙草基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。用從轉(zhuǎn)hrfA基因和AB片段的煙草中提取可溶性蛋白注射煙草都能引起過敏反應(yīng)，說明目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中能表達(dá)出有活性的蛋白?？共⌒澡b定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)N-末端AB片段的煙草和轉(zhuǎn)hrfA全長基因的煙草一樣表現(xiàn)出對TMV的抗性［15］。2008年，李黎等將來自粟酒裂殖酵母的pac1基因?qū)朐吮磉_(dá)載體pET-5a中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（DE3）pLysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，其表達(dá)產(chǎn)物能夠降解4種植物病毒CMV、TMV、Rice black-streaked dwarf（RBSDV）、Rice dwarf virus（RDV）和3種類病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）、Coleus blumei vi原roid（CBVd）和 Hopstunt viroid（HSVd）的 dsRNA。將pac1導(dǎo)入雙元載體pBI121，并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，以煙草（品種NC89）組培苗的葉片為受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷、分化、再生和篩選培養(yǎng)，獲得了50株Kana抗性植株，收獲T1種子分別播種，對這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR、PCR-Southern和RT-PCR檢測，結(jié)果表明pac1基因已整合到受體基因組中［16］。同年，朱常香等分別以馬鈴薯Y病毒（PVY）、TMV和CMV全長衣殼蛋白（CP）基因?yàn)槟０?，通過設(shè)計(jì)PCR引物和亞克隆獲得PVY CP 3'端長度100 bp、TMV CP 3'端長度100 bp和CMV CP 3'端長度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因，并以此為模板構(gòu)建反向重復(fù)結(jié)構(gòu)嵌合基因的植物表達(dá)載體pRHPTC。將pRHPTC通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。通過該方法可獲得抗多種植物病毒的轉(zhuǎn)基因煙草［17］。2010年，宋莉等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S驅(qū)動(dòng)的干擾素基因ChIFN-琢轉(zhuǎn)化煙草，Southern雜交和Western雜交進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)化、表達(dá)檢測，重組蛋白的數(shù)量通過ELISA測定，對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行TMV接種試驗(yàn)，結(jié)果表明ChIFN-琢基因的轉(zhuǎn)化賦予了轉(zhuǎn)基因煙草對TMV的抗性，進(jìn)一步的熒光定量PCR差異表達(dá)檢測結(jié)果表明，該抗性可能與轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)防衛(wèi)基因PR-la、抗病N基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)MAPK基因受到上調(diào)表達(dá)有關(guān)［18］。2013年，江彤等為了獲得抗PVY轉(zhuǎn)基因煙草，分別擴(kuò)增PVY HC-Pro基因3'端正、反向片段，構(gòu)建反向重復(fù)植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化普通煙草品種云煙85，經(jīng)抗性篩選及抗病性鑒定，獲得T0代轉(zhuǎn)基因抗病煙草株系。繁殖T0代抗病株系，抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，部分抗病株系的T1代煙株發(fā)生了一定比例的抗感分離。Real-time PCR檢測發(fā)生抗感分離的T1代煙株發(fā)現(xiàn)，抗病煙株中PVY HCPro基因RNA積累水平顯著低于感病煙株，說明抗病煙株中HC-Pro基因發(fā)生了RNA沉默。利用dsRNA技術(shù)沉默HC-Pro基因，獲得了煙草品種云煙85的T1代轉(zhuǎn)基因抗PVY株系［19］。同年，孫書娥等應(yīng)用RNA沉默防治病毒病原理構(gòu)建中國番茄黃化曲葉病毒（TYLCCNV）外殼蛋白部分基因片段dsRNA（double-strand RNA）導(dǎo)入本氏煙（Nicotiana benthamiana）獲得了抗TYLCCNV的轉(zhuǎn)基因煙草，結(jié)果表明，目的基因已整合到轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組中［20］。

2 抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草

2.1 利用蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因

提高煙草抗蟲性的第一種策略是利用蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因，Bt-toxin基因是目前世界上應(yīng)用最為廣泛的抗蟲基因，其表達(dá)產(chǎn)物可與昆蟲中腸道刷狀緣表皮細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合，干擾鉀ATP酶活性，造成離子滲漏，破壞細(xì)胞的滲透平衡，進(jìn)而引起細(xì)胞腫脹和裂解，并最終導(dǎo)致昆蟲死亡。

1987年，Vaeck等獲得了世界上首例轉(zhuǎn)Bt基因的工程植株。方法是使用全長的和3'缺失的Cryla（b）基因，在甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子的下游轉(zhuǎn)化煙草，試驗(yàn)證明在3'端有缺失的Cryla（b）殺蟲基因的轉(zhuǎn)基因煙草具有一定的抗蟲性［21］。1991年，田穎川等利用定點(diǎn)突變改造蘇云金桿菌（Bacil原lus thuringiensis）HD-1的δ-內(nèi)毒素基因 5'端，酶切對3'端進(jìn)行缺失后，在大腸桿菌中仍能表達(dá)出有殺蟲活性的被修飾的毒蛋白。將上述加工過的基因插入到雙元載體pBin437（pBin19的派生質(zhì)粒）中，借助輔助Ti質(zhì)粒pAL4404轉(zhuǎn)入煙草，獲得了抗卡那霉素的再生植株。經(jīng)Southern印跡和狹槽印跡（Slot blot）雜交證明有1～5個(gè)拷貝的毒素基因整合至煙草染色體中。Nolthern印跡法分析結(jié)果表明，這2類基因都在轉(zhuǎn)基因植株中得到表達(dá)，有4株5.3 kb類型，3株6.6 kb類型的轉(zhuǎn)基因植株對煙青蟲有高抗性，與對照相比，這7株轉(zhuǎn)基因煙草植株的殺蟲率可達(dá)40%～50%，并能顯著抑制昆蟲蛻皮和生長發(fā)育，表現(xiàn)明顯的抗蟲作用。結(jié)果表明，這2類毒蛋白基因都可在植物中表達(dá)并賦于轉(zhuǎn)基因植株以抗蟲性［22］。

2003年，謝龍旭等構(gòu)建了含草甘膦抗性突變基因（aroAM12）和人工合成重組Bt抗蟲基因（Bts1m）的植物表達(dá)載體 pcM12-slm。Northern blot、Immunodot blot分析進(jìn)一步證明整合的2個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上均進(jìn)行了表達(dá)，不同植株之間表達(dá)存在著差異。草甘膦抗性和蟲試試驗(yàn)證明，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草對草甘膦和煙青蟲具有很強(qiáng)的抗性［23］。2012年，高川等從蘇云金芽胞桿菌中克隆到的2個(gè)殺蟲基因Cry2Ab4和vip3Aall，分別構(gòu)建了pCS2Ab和pCScip3A植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草品種NC89，并得到32株和35株陽性轉(zhuǎn)基因植株。通過對其進(jìn)行RTPCR分析、Western雜交分子檢測證實(shí)2種外源基因在煙草植株中可正常表達(dá)。人工飼喂初齡小地老虎幼蟲，對2種轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生物活性檢測，結(jié)果顯示飼喂轉(zhuǎn)基因葉片的小地老虎幼蟲死亡率在82%以上，抗蟲能力比對照顯著提高［24］。

2.2 利用蛋白酶抑制基因組

另一種抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草的獲得的方法是利用蛋白酶抑制基因組。蛋白酶抑制劑（Proteinasein-hibitor，PI）是一類存在于某些植物中的蛋白質(zhì)，可與昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶相互作用，形成酶-抑制劑復(fù)合物（EI），由此抑制蛋白消化酶的活性。此外，蛋白酶抑制劑還可進(jìn)入昆蟲淋巴系統(tǒng)，干擾昆蟲免疫功能和蛻皮過程。

1987年，Hilder用土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)，將花椰菜葉病毒CaMv 35S啟動(dòng)子與豇豆胰蛋白酶抑制基因組裝后轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草植株具有較強(qiáng)的抗蟲特性［25］。2010年，宋洪元等將置于2個(gè)同向lox位點(diǎn)之間的Bar基因表達(dá)盒與大豆胰蛋白酶抑制劑SKTI基因表達(dá)盒融合后獲得相應(yīng)植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草Wisconsin 38后獲得對棉鈴蟲具有明顯抗性的SKTI轉(zhuǎn)基因植株。此外，作物育種專家還利用其他抗蟲基因及轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因，獲得了具有較好抗蟲性的煙草［26］。2012年，齊洪華等根據(jù)已克隆的CABYV P0蛋白基因序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體的P0蛋白基因正反義片段。將正反義片段分別插入含有內(nèi)含子的中間載體pBSint上，得到重組的中間載體pBSint-P0-F-R。用Sal I和Sac I雙酶切pBSint-P0-F-R，將切下的包括內(nèi)含子和正反義P0蛋白基因在內(nèi)的片段定向克隆到植物表達(dá)載體pCambial 300上，得到含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體pCambia-P0-F-R。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本生煙，經(jīng)PCR檢測，得到4株陽性轉(zhuǎn)基因植株［27］。

3 展望

雖然煙草抗病蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展已有20多年的歷史，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍有許多不足。目前，人們對轉(zhuǎn)基因植物的安全性存在疑慮，并且轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身還存在一些缺陷，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因沉默，基因漂移，轉(zhuǎn)基因抗病植株抗性的喪失以及抗病性轉(zhuǎn)基因的生態(tài)威脅方面，但任何事物都有兩面性，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)將會(huì)在植物抗病育種中得到很好的應(yīng)用。

通過20多年的研究，煙草抗病蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了較大的進(jìn)展，特別是近年來發(fā)展了一些新的介導(dǎo)抗病性方法。但仍存在許多缺陷，如基因沉默現(xiàn)象使轉(zhuǎn)入抗病基因的植株抗病性不能正常表達(dá)；PTGS效應(yīng)對整個(gè)生物體的影響不明確，對不同的作用靶位，其效應(yīng)存在差異，通過PTGS途徑獲得的抗病性在植物內(nèi)是否可以遺傳目前仍不清楚。另外，一些介導(dǎo)病毒抗性的方法對導(dǎo)入基因的作用機(jī)制及其與植物體互作方面的研究沒有確定的理論，并且在實(shí)際應(yīng)用中未取得太大的進(jìn)展。以后的研究工作中，應(yīng)對各種介導(dǎo)病毒抗病性的機(jī)制和作用機(jī)理以及互做體系進(jìn)行更準(zhǔn)確、深入的研究，以便從根本上解決問題，進(jìn)而促進(jìn)抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草更快、更有效的發(fā)展。

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