王興政，楊 寧，陳紅剛，劉效瑞，王富勝

（1.甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 定西 743000；2.西北師范大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730010）

我國中藥材資源豐富，是世界中藥材的主產(chǎn)國，對中藥材的研究有幾千年歷史。中藥材的品質(zhì)關(guān)系到臨床用藥的安全有效，發(fā)展道地藥材是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵，也是占有市場、增強(qiáng)產(chǎn)品競爭力的基本保障。當(dāng)前，藥材道地性研究已經(jīng)成為中醫(yī)藥科研的重要課題。

板藍(lán)根（Radix Isatidis）為2年生草本十字花科植物菘藍(lán)（Isatis factionindigotica Fort）的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傳統(tǒng)抗病毒中藥之一。板藍(lán)根味苦、性寒，歸心、胃經(jīng)，有清熱解毒、涼血利咽之功效［1-2］。近年來的研究表明，板藍(lán)根具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗內(nèi)毒素的作用［3］，廣泛用于治療流感、腮腺炎、溫病發(fā)熱、發(fā)斑、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎和肝炎等多種疾病［4］。

然而目前甘肅板藍(lán)根栽培中普遍使用傳統(tǒng)栽培育種方法，栽培品種為板藍(lán)根屬多種類型的混和體，田間表現(xiàn)良莠混雜，難于管理，且品系親緣關(guān)系不明確，缺乏品系鑒定的分子依據(jù)，嚴(yán)重制約著當(dāng)?shù)匕逅{(lán)根的產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)中迫切需要優(yōu)勢新品種的選育鑒定。另外，藥材的道地性一直是評價藥材品質(zhì)的綜合性標(biāo)準(zhǔn)，而產(chǎn)生道地性的原因，除了與栽培方法、生態(tài)環(huán)境、加工方法有關(guān)外，還與物種居群的遺傳特異性有關(guān)。道地藥材與非道地藥材在形態(tài)和生藥性狀等特征上的差別并不明顯，這給應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒別道地藥材帶來了困難。

隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)以其操作簡單、快速、花費(fèi)少、DNA用量少、無放射性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于中草藥種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性及藥材道地性研究等方面［5-6］。本研究正是基于甘肅省板藍(lán)根生產(chǎn)及銷售實際中不能提供科學(xué)的藥材道地性鑒定等問題，利用RAPD技術(shù)對甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的板藍(lán)根新品系BLG2012-04與當(dāng)?shù)卮筇镌耘喾N進(jìn)行分析鑒定，考證其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為甘肅省板藍(lán)根的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供部分分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用2個板藍(lán)根樣品種子分別為培育品系BLG2012-04和當(dāng)?shù)卮筇镌耘喾N（CK），均由甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，種子采集于2014年9月，每個樣品均采集種子500粒。

1.2 方法

1.2.1 板藍(lán)根種子的萌發(fā) 挑選顆粒飽滿均勻的板藍(lán)根種子，用1 g/kg次氯酸鈉溶液表面消毒10 min，用蒸餾水少量多次沖洗若干次，至無次氯酸鈉味道為止。消毒過程中輕搖數(shù)次，以提高消毒效果［7］。取10個花盆，分為BLG2012-04和CK兩組，每組5盆。每盆中均勻撒播30粒種子，覆土2 cm。培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照強(qiáng)度1 000～2 000 Lx、每天連續(xù)光照12 h，每隔48 h澆水1次。

1.2.2 DNA的提取 采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取植物基因組DNA，所用試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。提取后的DNA在4℃保存待用，對提取的2個供試材料的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確保為后期PCR擴(kuò)增提供良好的模板。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD普通型PCR儀上進(jìn)行，RAPD引物由北京奧科生物技術(shù)公司生產(chǎn)，所用Taq酶購自天根生化科技（北京）有限公司。

RAPD反應(yīng)體系：模板DNA 1μL，隨機(jī)引物2μL，Taq酶10μL，加ddH2O至20μL。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min后，94℃1 min，30℃1 min，72℃1 min，共計35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，UVI凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察照相。每實驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照Williams等的方法［8］。電泳擴(kuò)增圖譜中的每條帶（DNA片段）均為1個分子標(biāo)記（Marker），并代表1個引物結(jié)合位點。根據(jù)各分子標(biāo)記在相同電泳遷移率下（相同分子量片段）的有無，統(tǒng)計得到所有位點的二元數(shù)據(jù)，有DNA擴(kuò)增帶（顯性）為1，無帶（隱性）記為0，強(qiáng)帶和弱帶賦值為1。對于多態(tài)性位點，采用在重復(fù)試驗中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物擴(kuò)增品系BLG2012-04和當(dāng)?shù)卮筇镌耘喾N的結(jié)果

通過引物篩選，對2個品系挑選出譜帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性較豐富的11條隨機(jī)引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物分別為P1、P2、P4、P5、P7-P13。所用引物及擴(kuò)增條帶數(shù)見表1。對于BLG2012-04品系，11條引物共擴(kuò)增出119個位點，不同引物的擴(kuò)增位點變幅為8～13個，平均每條引物能擴(kuò)增出10.8個位點；對于CK，11條引物共擴(kuò)增出119個位點，不同引物的擴(kuò)增位點變幅為8～14個，平均每條引物能擴(kuò)增出10.8個位點。

2.2 相同引物擴(kuò)增品系BLG2012-04和當(dāng)?shù)卮筇镌耘喾N的結(jié)果

利用11條引物，分別擴(kuò)增兩品系，從而在分子水平上反映兩品系間的遺傳差異性。篩選出的11 條引物分別為 P1、P2、P4、P5、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13（引物及其擴(kuò)增條帶數(shù)見表1）。結(jié)果顯示，BLG2012-04和CK的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，但是兩者間的次譜帶存在一定差異。相同引物擴(kuò)增2個品系產(chǎn)生的總位點數(shù)的范圍為16～27個，其中多態(tài)性位點的差異變幅為1～2個。這說明2個品系之間存在遺傳學(xué)差異，表現(xiàn)出具有遺傳多態(tài)性位點（圖1）。

表1 引物序列和對BLG2012-04及CK的擴(kuò)增結(jié)果

圖1 BLG2012-04和CK的RAPD電泳圖譜

3 結(jié)論與討論

1）影響PCR擴(kuò)增條帶的因素有模板DNA、引物、dNTPs量、Taq酶、退火溫度、電泳中的瓊脂糖濃度、電泳時間等。本研究對退火溫度和電泳時間這兩個因素進(jìn)行了優(yōu)化分析，最終確定了板藍(lán)根材料的最適RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為模板DNA 1μL，隨機(jī)引物 2μL，Taq酶 10μL，ddH2O 7 μL；RAPD引物最佳退火溫度為30℃，最適瓊脂糖濃度為1%。此體系的建立可以為其他板藍(lán)根品系的RAPD擴(kuò)增提供參照依據(jù)。

2）RAPD是一種顯性標(biāo)記，能從分子水平上揭示材料間存在的遺傳差異［9-11］。從RAPD的結(jié)果可以看出，2個不同的供試材料的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性。表明甘肅省新選育的板藍(lán)根品系BLG2012-04和當(dāng)?shù)卮筇镌耘喾N之間的遺傳關(guān)系較近。這種情況可能是由于在板藍(lán)根種植過程中，兩個品系之間的地理分布近，并且板藍(lán)根是自交不親和的異花授粉植物，從而使不同板藍(lán)根品系間相互授粉的幾率大大提高，造成品系間的遺傳關(guān)系較近。次譜帶存在不同程度的差異，多態(tài)性位點的差異變幅為1～2個。這在分子水平上說明板藍(lán)根品系BLG2012-04與當(dāng)?shù)卮筇镌耘喾N具有一定的遺傳差異性。

［1］ 王興政，劉效瑞，楊薇靖.6個板藍(lán)根新品系在定西市的品比試驗報［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2014（5）：14-16.

［2］ 楊薇靖，王興政.定西半干旱區(qū)板藍(lán)根栽培技術(shù)［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2013（5）：66-67.

［3］ 陳 慶.板藍(lán)根藥理作用與臨床應(yīng)用［J］.中國藥事，2009，23（6）：607-608.

［4］ 安益強(qiáng)，賈曉斌，袁海建，等.板藍(lán)根抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路［J］. 中草藥，2008，39（4）：616-619.

［5］ 鄭學(xué)項，馮素萍，李維國.DNA分子標(biāo)記研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（26）：12 420-12 422.

［6］ 任愛農(nóng)，秦民堅.基于RAPD分子標(biāo)記技術(shù)的中藥材鑒定研究進(jìn)展［J］. 中南藥學(xué)，2008，6（3）：338-341.

［7］ 吾拉爾古麗，王建華，李先恩.板藍(lán)根種子發(fā)芽試驗標(biāo)準(zhǔn)化研究［J］. 種子，2005，24（6）：34-36.

［8］ WILLIAMS J G，KUBELIK A R，LIBAK K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nuc Aci Res，1990，18（22）：6 531-6 535.

［9］ 梁慧敏.不同居群狗牙根RAPD分析［J］.草業(yè)學(xué)報，2010，19（1）：258-262.

［10］ 劉 歡，慕 平，趙桂琴.基于AFLP燕麥遺傳多樣性研究［J］. 草業(yè)學(xué)報，2008，17（6）：121-127.

［11］ 解新明，盧小良.利用RAPD標(biāo)記分析狼尾草屬牧草品種間的遺傳關(guān)系［J］. 草業(yè)學(xué)報，2005，14（2）：52-56.