謝 雍，張里程，呂厚辰，尹鵬濱，張立海，唐佩福

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

破骨前體細胞在骨吸收中的作用和雙光子顯微鏡活體觀察破骨前體細胞的研究

謝 雍，張里程，呂厚辰，尹鵬濱，張立海，唐佩福

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

近年來在骨質(zhì)疏松和骨折愈合機制研究中，破骨細胞和破骨前體細胞在骨吸收中的相互作用越來越受到重視，被認為是未來藥物治療骨質(zhì)疏松乃至其他骨質(zhì)破壞疾病的關鍵策略和重要靶點。本文綜述了趨化因子-1通路(CX3CL1-CX3CR1 pathway)和1-磷酸鞘氨醇信號(S1P signal)及其受體在破骨細胞和破骨前體細胞間調(diào)控作用的最新研究進展。同時還對最近文獻中出現(xiàn)的使用雙光子顯微鏡活體觀察破骨細胞和破骨前體細胞的方法進行了介紹，該方法被認為開啟了骨科研究領域的新時代。

破骨前體細胞；1-磷酸鞘氨醇；趨化因子1受體；雙光子顯微鏡

骨是人體中高度活躍的器官，處在破骨細胞主導的骨破壞和成骨細胞主導的骨形成的動態(tài)平衡中[1]，這種平衡受到機體內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)控。在骨受到損傷或是發(fā)生炎癥和產(chǎn)生腫瘤的情況下，這種動態(tài)平衡就會被打破。主要表現(xiàn)為骨質(zhì)破壞作用和骨質(zhì)吸收作用增強，造成骨質(zhì)的丟失，隨之產(chǎn)生一系列癥狀和體征[2]。而在骨質(zhì)疏松和骨折愈合過程中，這種動態(tài)平衡的紊亂和其病理生理變化還沒有被完全闡明[3]。研究者越來越關注其中的調(diào)控機制，以求能夠找到新的治療靶點和選擇更有效的治療方法。傳統(tǒng)方法研究破骨細胞和破骨前體細胞相互作用機制只能通過標本觀察，受制于時空特性，不能有效地觀察到活體內(nèi)實際的細胞運動[4]。而隨著綠色熒光蛋白標記趨化因子-1受體(CX3CR1-EGFP)雜合轉基因小鼠和雙光子顯微鏡技術的不斷成熟，活體觀察破骨前體細胞的分化遷移過程成為了可能。近期Ishii等通過雙光子顯微鏡和遺傳修飾動物對S1P在活體內(nèi)對破骨前體細胞的調(diào)控作用進行了觀察和研究。下面就對以上研究的進展和采用的研究方法做一綜述。

1 破骨細胞和成骨細胞在骨重塑中的作用

破骨細胞和巨噬細胞同源于造血干細胞，并且共用一種前體細胞。成骨細胞則是來源于間葉組織干細胞系[5]。后有研究證明，破骨前體細胞表達NF-κB受體激活蛋白(receptor activator of nuclear factorκB，RANK)，其配體是κB受體激活蛋白配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)，是來自于由干細胞分泌的腫瘤壞死因子家族的一類三聚體[6]。破骨細胞和成骨細胞在骨重塑過程中具有緊密的關系，破骨前體細胞附著到骨表面后，在RANKL的刺激下分化成為成熟的破骨細胞，開始產(chǎn)生骨吸收作用，同時引發(fā)成骨細胞分化，在已經(jīng)破壞的骨質(zhì)上重建骨細胞，形成新骨[7]。該過程被分為3個階段[1]，起始階段開始于造血前體細胞的聚集，破骨細胞分化由成骨細胞表達的RANKL誘導產(chǎn)生，成熟的破骨細胞開始骨吸收作用[8]；而過渡階段則以通過偶聯(lián)因子完成的骨重塑轉換為標志，這一階段中還存在著破骨細胞的凋亡[9]；結束階段中，新骨在成骨細胞誘導的骨重塑作用中將被破骨細胞吸收的骨質(zhì)空隙填滿，隨后進入靜止期[10]。其中破骨前體細胞分化為破骨細胞的過程被認為受多種生長因子和激素的影響，如甲狀旁腺激素，主要通過影響巨噬細胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulating factor，M-CSF)和RANKL的表達來影響破骨前體細胞的分化[11]。日本學者最先報道了CX3CL1-CX3CR1通路在破骨細胞分化中的作用，隨后又有學者進一步闡釋了該通路在維持骨質(zhì)動態(tài)平衡中的機制[12]。

2 破骨前體細胞向破骨細胞的分化

破骨前體細胞向破骨細胞的分化過程是在一系列特殊因子的調(diào)控下完成的，其中M-CSF和RANKL是兩種主要的因子，它們通過激活多重細胞內(nèi)信號通路來調(diào)控破骨細胞基因的轉錄和表達[11]。M-CSF是破骨前體細胞增殖和存活的關鍵因子。是由成骨細胞和基質(zhì)細胞生成，并與表達在早期破骨前體細胞上的巨噬細胞集落刺激因子受體(macrophagecolony-stimulating factor receptor，M-CSFR)識別[13]。M-CSF還通過激活小眼相關轉錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor，Mitf)作為破骨前體細胞的存活因子，并刺激破骨前體細胞表達RANK[14]。

RANKL-RANK通路使多種破骨細胞基因表達，包括抗酒石酸酸性磷酸酶和基質(zhì)金屬蛋白酶9。而RANKL，作為腫瘤壞死因子α家族的一員，是在諸如維生素D3、甲狀旁腺激素等激素和因子的誘導下由成骨細胞和基質(zhì)細胞產(chǎn)生的[15]。骨保護素作為一種可溶性的餌受體可以阻止RANKL-RANK通路[16]。在破骨細胞形成過程中，RANKL和RANK的結合會誘導腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis actor receptor associated factors，TRAFs)到RANK的細胞質(zhì)，進而刺激下游信號，包括核轉錄因子κB和活化T細胞核因子1蛋白[17]。

3 CX3CL1-CX3CR1通路對于破骨細胞和破骨前體細胞的調(diào)控

趨化因子-1(Fractalkine，CX3CL1)是一種兼有黏附和趨化活性的趨化因子。其主要作用為趨化和激活白細胞，參與炎癥反應[12]。在趨化因子家族中，根據(jù)其氨基端保守半胱氨酸殘基的數(shù)目和間隔的結構特點，可分為4個亞族，即CC，CXC，C和CX3C族。在CX3C族中已知的趨化因子是人的Fractalkine，鼠的同系物稱為神經(jīng)趨化因子(neurotactin)。Fractalkine與其他趨化因子的最大區(qū)別在于它是一種跨膜糖蛋白[18]。Fractalkine的一種高親和力受體CX3CR1，趨化因子β受體類似物-1，屬于趨化因子受體超家族，具有7次跨膜G-蛋白偶聯(lián)結構域。其基因位于染色體3p21-3pter，鄰近CCR的基因族。將小鼠的CX3CR1基因用綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)報告基因替代后，小鼠存活并發(fā)育為成鼠，無自發(fā)的特異性改變[19]。

據(jù)Koizumi等[12]報道，CX3CL1在成骨細胞誘導的破骨細胞分化中作為CX3CR1特異性配體。他們發(fā)現(xiàn)破骨前體細胞選擇性地表達CX3CR1，而CX3CL1是由成骨細胞表達?？扇苄缘腃X3CL1誘導包括破骨前體細胞在內(nèi)的骨髓細胞的遷移，不可溶的CX3CL1則調(diào)控著破骨前體細胞的的黏附作用。他們進一步研究用單克隆抗體(MAB)阻斷CX3CL1可以有效地抑制破骨前體細胞分化，并且通過降低成熟破骨細胞的數(shù)量顯著降低了骨吸收。由此認為該通路可以成為骨吸收疾病治療干預的重要靶點。

Hoshino等[20]在現(xiàn)有的理論基礎上，通過研究CX3CR1基因缺陷小鼠，進一步闡述了CX3CL1-CX3CR1通路在活體骨代謝中的生理作用。他們發(fā)現(xiàn)這種CX3CR1基因缺陷小鼠表現(xiàn)出顯著的成骨反應，破骨細胞的數(shù)量明顯下降，骨皮質(zhì)和骨小梁的密度有所提高。破骨細胞相關基因的轉錄水平也明顯下降。進一步的體外免疫熒光染色實驗表明，CX3CL1-CX3CR1通路主要在成骨細胞分化的早期階段起作用。并且指出，該通路的主要作用是維持破骨前體細胞的聚集而不是誘導分化破骨細胞。

Han等[21]研究鼠骨的電離輻射模型，進一步報道CX3CL1-CX3CR1通路并不調(diào)控破骨細胞的分化，而是促進破骨細胞的聚集，從而加強骨吸收作用。并觀察到，無論是CX3CL1還是CX3CR1都沒有像其他趨化因子一樣的交叉作用和相互影響，這種獨立的作用易于成為治療骨質(zhì)丟失的干預靶點。

另有研究表明，趨化因子-12通路(CXCL12/SDF-1-CXCR4 pathway)也能促進破骨前體細胞的趨化聚集和發(fā)展存活，CXCL12/SDF-1大量存在于骨髓腔的血管周邊有炎性破壞的區(qū)域，而CXCR4則在破骨前體細胞表面大量表達[22]。

4 Sphingosine-1-phosphate信號控制破骨細胞和骨的動態(tài)平衡

首先，破骨細胞是來源于體內(nèi)單核巨噬細胞系中的前體單核細胞的分化，這種分化需要兩種重要的分子：M-CSF和RANKL。盡管破骨前體細胞在什么階段遷移到骨表面還存在爭議，但已有研究表明，S1P扮演了重要角色[23]。

S1P是生物活性神經(jīng)鞘磷脂的代謝產(chǎn)物，調(diào)控多種的生物功能。在生物組織中的含量相對較低，主要由血管內(nèi)皮細胞合成，在血漿內(nèi)大量的存在[23]。S1P信號是通過5種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體轉導的，1-磷酸鞘氨醇受體(S1PR1 to S1PR5)。而S1PR1和S1PR2在調(diào)控細胞遷移時，根據(jù)S1P梯度的不同產(chǎn)生相反的作用[22]。

日本學者Ishii等[24]利用活體雙光子顯微鏡技術揭示了S1P控制破骨前體細胞在骨組織和血流中遷移的重要作用。通過使用一種活體內(nèi)雙光子顯微鏡，在熒光蛋白標記技術的幫助下，可以觀察到S1P在血液中濃度較高，這時S1PR2表現(xiàn)出一種趨化排斥作用，誘導破骨前體細胞進入S1P濃度較低的骨髓腔內(nèi)；而進入骨髓腔內(nèi)的破骨前體細胞，由于低S1P濃度的作用，S1PR1則表現(xiàn)出趨化吸引作用，使破骨前體細胞由骨髓腔回到血管內(nèi)[25]。另外，一部分進入骨髓腔的破骨前體細胞，在成骨細胞表達的RANKL刺激下，附著在骨表面，分化為成熟的破骨細胞，進而加強骨吸收作用。

為了進一步驗證該作用，學者分別研究了S1PR1基因敲除小鼠和S1PR2基因敲除小鼠。發(fā)現(xiàn)S1PR1基因敲除小鼠的股骨密度明顯低于正常對照組，雙光子顯微鏡下骨標本的破骨前體細胞在骨表面的黏附聚集顯著高于正常對照小鼠[26]。S1PR2基因敲除小鼠的破骨細胞骨吸收作用明顯低于正常小鼠，而體外的破骨細胞形成沒有受到顯著影響[27]。

5 雙光子顯微鏡活體觀察破骨細胞和破骨前體細胞的應用

在激光照射下，基態(tài)熒光分子或原子同時吸收兩個光子而成激發(fā)態(tài)，這就是雙光子激發(fā)過程。將雙光子技術與各種顯微鏡技術相結合，在生物醫(yī)學領域發(fā)揮了重要作用，主要用于對神經(jīng)細胞和遞質(zhì)的觀察和研究[4]。雙光子熒光遠離激發(fā)波長，避免了激發(fā)光對熒光探測的影響，能實現(xiàn)暗場成像，背景噪聲小，圖像對比度高；焦點以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象；可用紅外或近紅外激光作光源，紅外光在生物組織中的穿透力強，能對生物組織的深層進行觀察成像[27]。

鈣磷作為骨組織的主要構成成分非常容易散射激光束，即使利用近紅外激光也很難觀察較厚的骨組織。研究者選用了鼠顱骨作為觀察對象，因為顱骨的表面到骨髓腔的距離為80 ～ 120μm，剛好是雙光子顯微鏡適合的觀察深度[28]。

將CX3CR1-EGFP雜合轉基因小鼠用異氟醚麻醉，頭頂部去除皮膚并固定，以便于使用雙光子顯微鏡進行觀察[25]。血管通過靜脈注射得克薩斯紅色高分子共軛葡聚糖顯示紅色。骨通過第2諧波熒光信號(second-harmonic generation)顯示為藍色。CX3CR1已被證明在破骨前體細胞中穩(wěn)定表達[12]，所以綠色熒光蛋白標記的CX3CR1-EGFP作為觀察破骨前體細胞的替代，顯示為綠色。研究人員對小鼠靜脈注射一種S1PR1的強力興奮劑SEW2871[29]，觀察到破骨前體細胞受到刺激并移動到血管中；S1PR2的強力拮抗劑JTE013[30]靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，也確實觀察到破骨前體細胞(即CX3CR1-EGFP)遷移回到血系中，而這種作用不如SEW2871的作用顯著。進一步驗證了S1P在對破骨前體細胞在血系和骨質(zhì)間遷移的作用。鹽酸芬戈莫德(FTY720)作為4種S1PR的拮抗劑，能夠緩解卵巢切除小鼠的骨質(zhì)疏松，這種作用是通過減少成熟破骨細胞在骨表面的數(shù)量完成的[31]。學者以此推斷調(diào)控破骨前體細胞的遷移將會是未來臨床的策略。

日本學者利用自己設計的熒光探針BAp-E，在活體內(nèi)產(chǎn)生的低pH環(huán)境下動態(tài)的顯示破骨細胞骨吸收的過程[32]。德國學者利用雙光子顯微鏡活體觀察技術，發(fā)現(xiàn)β-磷酸三鈣骨替代材料的體外降解不僅被破骨細胞影響，也受到巨噬細胞的吞噬[4]。

6 結語

我們看到控制和抑制破骨前體細胞對于調(diào)控骨吸收作用是一個很有前途的方向。使用雙光子顯微鏡活體觀察S1P受體基因敲除動物和使用S1P拮抗藥物干預后野生型動物的破骨前體細胞和破骨細胞的運動分化特點，有可能會找到S1P和S1P受體間相互作用的特點，進一步驗證該通路的正確性，排除其他因素的影響，確定靶點，選擇特異性更高的靶向藥物。

CX3CL1-CX3CR1通路和S1P通路之間在破骨前體細胞遷移乃至整個骨吸收重塑過程中存在怎樣的相互聯(lián)系，他們之間是如何進行調(diào)控的，還沒有相關報道。利用雙光子顯微鏡在活體中觀察兩種通路的相互作用也許會有新的發(fā)現(xiàn)。但是因為雙光子顯微鏡目前很難觀察厚組織和熒光標記物，目前對破骨細胞和破骨前體細胞的觀察還只能在鼠顱骨上進行。并且因為觀察的需要，要剔除頂部皮膚，使顱骨暴露，難免會造成觀察部位的損傷和其他理化因素的影響。這些操作對實驗結果準確性必然會造成一定影響。如何采用科學的實驗設計盡量避免這些因素的影響，也是未來需要解決的問題。

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Role of osteoclast precursors in bone resorption by two-photon microscope in vivo

XIE Yong, ZHANG Licheng, LYU Houchen, YIN Pengbin, ZHANG Lihai, TANG Peifu
Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

TANG Peifu． Email: pftang301@126．com

Recently, the interaction between osteoclast precursors and osteoclasts in osteroprosis and bone fracture healing has drawn more and more attention, which is considered to be the key therapeutic target in treating osteroprosis and other bone destruction diseases． This paper reviews the mechanism of the bone resorption, particularly focusing on the latest research progress regarding the regulatory function of CX3CL1-CX3CR1 pathways and S1P signal． And it also summarizes the method which involves two-photon microscope observation of osteoclasts and osteoclast precursor in vivo, which is considered to be able to open a new era in the field of orthopedic research．

osteoclast precursors; sphingosine-1-phosphate; CX3C chemokine receptor 1; two-photon microscope

R 336

A

2095-5227(2015)12-1246-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.023

時間：2015-07-17 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150717.1029.004.html

2015-05-11

國家自然科學基金面上項目(31271000；81401809)；博士后科學基金(2014M562549)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31271000; 81 401809); China Postdoctoral Science Foundation(2014M562549)

謝雍，男，碩士。研究方向：創(chuàng)傷骨科。Email: xysunflower @yeah.net

唐佩福，男，博士，主任醫(yī)師，教授。Email: pftang301@ 126.com